【摘 要】
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[目 的]随着碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiela pneumoniae,CRKP）检出率逐年增加,CRKP中高耐药合并高毒力菌株的治病率和死亡率都明显升高,给临床治疗带来了严峻的挑战。CRKP的高毒力与其铁载体的高表达密切相关,其中entB和ybtS基因在CRKP高毒力菌株中检出率较高,或许是造成CRKP高毒力表型的重要原因,因此本研究通过构建
【基金项目】
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国家自然科学基金（81960382）；
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[目 的]随着碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiela pneumoniae,CRKP）检出率逐年增加,CRKP中高耐药合并高毒力菌株的治病率和死亡率都明显升高,给临床治疗带来了严峻的挑战。CRKP的高毒力与其铁载体的高表达密切相关,其中entB和ybtS基因在CRKP高毒力菌株中检出率较高,或许是造成CRKP高毒力表型的重要原因,因此本研究通过构建铁载体毒力基因entB和ybtS的单基因/双基因敲除株和回补株;明确铁载体毒力基因对CRKP毒力的影响。[方法]1通过拉丝实验、粘液表型筛选、PCR扩增entB和ybtS基因,从本院收集到的30株临床分离CRKP菌株中筛选出目标菌株WT。2 CrispR-Cas9基因编辑技术构建entB基因缺失株ΔentB和回补株C-ΔentB,ybtS基因缺失株ΔybtS和回补株C-ΔybtS,entB和ybtS双基因缺失株ΔentB+ybtS和回补株C-ΔentB+ybtS,并通过PCR验证敲除及回补是否成功。3观察实验菌株的菌落形态并进行拉丝实验,初步了解实验菌株的毒力表型。4 CAS固体培养基和CAS检测液对实验菌株的产铁载体能力进行定性、定量检测。5测定24h内菌株的生长状况,绘制菌株生长曲线。6结晶紫染色法检测实验菌株的生物膜形成能力。7血清杀伤实验检测实验菌株抗血清杀伤的能力。8建立小鼠腹腔感染模型,观察小鼠生存率并绘制小鼠生存曲线,测定菌株LD50直观了解实验菌株毒力的强弱。针对小鼠的肺脏和肝脏,观察其组织病理学改变以及通过ELISA测定其炎症因子IL-1β、LI-3、TNF-α的含量,明确实验菌株在小鼠肺脏和肝脏的定植能力。[结果]1筛选出CRKP-27为目标菌株WT,特点为拉丝实验阳性、粘液性强、毒力强且同时携带entB和ybtS基因;并成功构建entB和ybtS基因的单基因/双基因敲除株和回补株。2铁载体毒力基因entB和ybtS对CRKP菌株的菌落形态、黏液表型（拉丝实验）和生物膜形成能力无明显影响。3铁载体产量:entB和ybtS基因使CRKP菌株的铁载体产量明显升高。ΔentB组与CRKP-27组和C-ΔentB组相比,铁载体产量分别下降了 11.7393%和11.9642%,差异有统计学意义;ΔybtS组与CRKP-27组和C-ΔybtS组相比,铁载体产量分别下降了 10.8000%和10.1360%,差异有统计学意义;ΔentB+ybtS组与CRKP-27组和C-ΔentB+ybtS组相比,铁载体产量分别下降19.1138%和16.6717%,差异有统计学意义。ΔentB组和ΔybtS组之间差异无统计学意义,但ΔentB+ybtS组铁载体产量下降更明显,与ΔentB组和ΔybtS之间差异均有统计学意义。4生长速率:entB和ybtS基因削弱了 CRKP菌株的生长速率。ΔentB组菌株的生长速率从测定的第3h开始加快,ΔybtS组菌株的生长速率则从测定的第14h才开始加快,两组菌株的生长速率都高于CRKP-27组及其回补株,且差异有统计学意义;ΔentB+ybtS组的生长速率一直低于CRKP-27组和C-ΔentB+ybtS组,且差异有统计学意义。5抗血清杀伤能力:entB和ybtS基因增强了 CRKP菌株的抗血清杀伤能力。ΔentB、ΔybtS和ΔentB+ybtS组的抗血清杀伤能力均比CRKP-27、C-ΔentB、C-ΔybtS和C-ΔentB+ybtS组弱,且差异有统计学意义。ΔentB、ΔybtS和ΔentB+ybtS组之间抗血清杀伤能力则并无差异。6感染后小鼠的生存率:entB和ybtS基因降低了小鼠感染CRKP菌株后的生存率。ΔentB、ΔybtS和ΔentB+ybtS菌株的LD50值与CRKP-27、C-ΔentB、C-ΔybtS和C-ΔentB+ybtS菌株相比都有3-5倍的增加。被ΔentB、ΔybtS和ΔentB+ybtS菌株感染的小鼠,其生存率与被CRKP-27、C-ΔentB、C-ΔybtS和C-ΔentB+ybtS菌株感染的小鼠相比都有明显升高,差异有统计学意义。7受感染小鼠肺脏和肝脏的组织病理学改变和炎症因子水平因entB和ybtS基因的存在而增强。ΔentB、ΔybtS和ΔentB+ybtS组均高于CRKP-27、C-ΔentB、C-ΔybtS和C-ΔentB+ybtS组,差异有统计学意义。受同一菌株感染的小鼠,其肺脏的组织病理学改变和炎症因子水平均高于肝脏,差异有统计学意义。[结论]1铁载体毒力基因entB和ybtS对CRKP菌株的菌落形态、粘液表型和生物膜形成能力无明显影响。2铁载体毒力基因entB和ybtS明显增加了 CRKP菌株的毒力,但削弱了其生长能力。
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