丝状真菌生产多不饱和脂肪酸的研究

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以深黄被孢霉(Mortierella isabellina)AS3.3410为出发菌株,诱变选育出多不饱和脂肪酸的高产菌株,以玉米糖为碳源,通过单因素实验、正交实验对深黄被孢霉突变株生产多不饱和脂肪酸的发酵工艺条件进行优化,对油脂进行分离、纯化研究,主要包括:1.为提高油脂产量,以深黄被孢霉(Mortierella isabellina)AS3.3410为出发菌株,利用紫外(UV)、氯化锂(Li Cl)进行复合诱变,通过乙酰水杨酸初筛、苏丹黑B染色、摇瓶复筛,筛选出高产多不饱和脂肪酸突变菌株,并对其遗传稳定性和油脂组成成分进行分析。结果表明,氯化锂浓度为0.6 g/L,紫外诱变时间20 s,初筛乙酰水杨酸浓度为0.6 g/L,诱变筛选出一株遗传稳定的突变株SLZH-20,生物量和油脂含量分别为22.76 g/L、52.30%,比出发菌株分别提高34.60%和24.30%;该菌株所产油脂中不饱和脂肪酸包括棕榈一烯酸、油酸、亚油酸、γ-亚麻酸、α-亚麻酸,含量为81.41%,较出发菌株AS3.3410的不饱和脂肪酸含量增加5.72%。其中多不饱和脂肪酸含量为16.24%,较出发菌株AS3.3410增加了2.18%。2.以玉米粉糖液为碳源,用深黄被孢霉突变株SLZH-20发酵生产多不饱和脂肪酸。以生物量和油脂产量为评价指标,研究氮源种类和浓度、碳源浓度、硫酸镁浓度、接种量、p H、温度和时间对菌株发酵效果的影响。通过单因素及正交实验优化确定发酵条件,结果表明,选定氮源为酵母粉、碳氮源比30:1,最佳发酵条件为碳源质量浓度80.0 g/L、氮源2.7 g/L、硫酸镁0.7 g/L、柠檬酸钠2.0 g/L、磷酸二氢钾2.0 g/L、接种量10%、p H6、温度26℃、时间6 d。根据生物量和油脂产量的正交实验优化结果进行验证实验,结果表明,菌体生物量和油脂产量分别达到了26.12 g/L、14.63 g/L。经气相色谱分析,深黄被孢霉突变株SLZH-20油脂中脂肪酸组成为肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈一烯酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生酸、γ-亚麻酸、α-亚麻酸,其中不饱和脂肪酸含量81.45%,多不饱和脂肪酸含量16.28%。3.为了提高发酵生产后油脂中的PUFAs的含量,需要进行甲酯化和尿素包合研究。以脂肪酸油脂收率为评价指标,探究油醇比(油脂:甲醇)、氢氧化钾浓度、回流温度和回流时间对脂肪酸甲酯化效果的影响。通过单因素实验确定脂肪酸甲酯化条件,结果表明,最佳酯化条件为油醇比1:5、氢氧化钾浓度1.3%、回流温度60℃、回流时间30 min。以脂肪酸油脂收率和多不饱和脂肪酸含量作为评价指标,研究脂肪酸油脂与尿素比例、尿素和乙醇比例、包合温度和包合时间对尿素包合工艺的影响。通过单因素及正交实验优化确定尿素包合工艺,结果表明,最佳条件为脂肪酸油脂与尿素比例为1:2.5(g:g)、尿素和乙醇比例为1:4(g:m L)、包合温度-10℃、包合时间18 h。根据尿素包合收率和尿素包合含量的正交实验优化结果进行验证实验,结果表明,脂肪酸油脂收率和多不饱和脂肪酸含量达58.7%和54.6%。经气相色谱分析后,脂肪酸油脂经尿素包合分离后得到的多不饱和脂肪酸主要由C18不饱和脂肪酸油脂组成,即由油酸、亚油酸和γ-亚麻酸组成,其中亚油酸为34.4%,γ-亚麻酸为19.1%。
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