研究背景肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是泌尿系统肿瘤中发病率最高的恶性肿瘤之一,占成年人恶性肿瘤比例的2%-3%,而最常见的类型是透明细胞性肾细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC),其侵袭性较高。除了手术治疗,其它治疗方案的效果欠佳,而且即使可以行手术治疗,患者的复发率及转移率仍较高,最高可达40%。因此研究RCC的潜在转移机制,将具有重大的应用价值。本课题应用mRNA高通量表达谱芯片技术,通过比对分析RCC组及相应癌旁正常肾组织组的差异表达基因,结合文献复习,最终选择了 MAG11(membrane-associated guanylate kinase with an inverted repeat member 1)作为本实验的研究对象。目前,关于MAGI1基因的报道少见,尚未发现有关MAGI1在RCC中的表达及与RCC转移机制的文献报道。MAGI1属于鸟苷酸激酶家族的成员,主要编码细胞骨架蛋白,具有维持细胞形态、传导信息等作用。此外,该基因还参与细胞的多种生物学过程,比如在细胞增殖发育、细胞凋亡以及RNA剪切过程中均发挥作用。目前研究表明,MAGI1在细胞粘附连接的稳定中起重要作用,在多种人类恶性肿瘤中表达量存在差异,并且已被确定抑制多种癌症的侵袭和转移。肝癌细胞中,MAGI1依靠上调PTEN的表达降低肿瘤细胞的侵袭和迁移。结直肠癌细胞中,MAGI1在表达上调后可以减缓结直肠癌细胞的迁移,同时依靠Wnt/β-catenin信号通路降低细胞增殖。胃癌中,MAGI1通过阻断MAPK/ERK信号通路抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。然而,MAGI1在RCC转移中的机制尚不明了。本实验拟揭示MAGI1在RCC中的生物学功能及其相关作用机制,为MAGI1在RCC诊断和治疗中的临床应用提供经验借鉴。microRNA(miRNA)是一类内源性非编码小RNA,长度约18～25nt,由一段具有发夹样环状结构,长度约70～80nt的单链RNA前体(pre-miRNA)剪切之后获得。miRNA参与机体的基因表达和调控。在哺乳动物中,miRNA主要通过碱基间的非完整互补配对进行mRNA的识别,并依据碱基配对的程度不同,能够抑制靶mRNA的翻译或者直接降解靶mRNA。目前认为miRNA调节目标基因表达的方式有两种:一是miRNA与靶基因mRNA的3’端非编码区(3’UTR)非完整互补配对,从而终止靶基因的翻译过程;二是miRNA和靶基因mRNA的3’UTR能够实现完整的互补配对,与siRNA通过降解靶基因mRNA而沉默mRNA的作用机理相类似,两者的不同之处在于:siRNA和miRNA针对的靶基因数目不同,前者针对的是一个靶基因,而后者可以针对多个靶基因。迄今为止,己有相关研究明确指出,miRNA对细胞的生长、分化以及凋亡的调节起到关键作用。最新研究表明,miRNA能够同时干预多条与肿瘤转移有关的信号通路,从而调控肿瘤细胞的转移。我们通过starBase、TargetScan和miRWalk三个生物信息数据库预测筛选出20个可能靶向MAGI1的miRNAs,通过数据分析,预实验及文献复习,我们最终选取miRNA-520h作为研究对象。miRNA-520h在多种肿瘤发生发展过程中发挥重要作用。研究发现成熟miRNA-520h通过NF-κB信号途径诱导胶质瘤的发生,miRNA-520h与Nix蛋白的表达相关,可能通过促进Nix合成,从而成为一个强大的肿瘤激活剂。另一项研究表明,miRNA-520h的过表达可以通过保护细胞免受紫杉醇诱导的细胞凋亡,从而促进人乳腺癌细胞的耐药性。高表达的miRNA-520h与人乳腺癌患者的不良预后和淋巴结转移相关。由此可见,miRNA-520h不仅是一个独立的肿瘤预后因素,而且也是未来癌症治疗应用的潜在功能靶点。目前,尚未发现有关miRNA-520h在RCC转移中的相关报道。研究目的明确miRNA-520h及MAGI1在RCC中的表达及其意义,分析两者之间的作用关系,探究两者在RCC转移中的分子机制。材料和方法:1.收集从2015年9月至2018年5月期间山东大学齐鲁医院泌尿外科肾癌切除术患者的组织块(癌组织及其癌旁组织)存放在液氮中。对应组织学切片经2名高年资病理医师复核确诊为肾细胞癌的病理组织共计73例,收集患者性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期、Fuhrman分级、病理学类型等临床参数。2.通过免疫组织化学和RT-qPCR技术检测73例RCC患者MAGI1蛋白及其mRNA表达情况,并且进一步分析其与临床参数间的关系;因本研究中无患者临床预后相关数据,结合分析了来自TCGA数据库中的ccRCC患者预后数据进行Kaplan-Meier生存分析;免疫荧光染色判断73例RCC患者中MAGI1表达情况与肿瘤分期相关性。3.在A-498和ACHN细胞中构建MAGI1过表达和MAGI1敲低细胞系;然后分别用Western Blot和RT-qPCR检测MAGI1在蛋白水平和mRNA水平上表达的改变;通过细胞划痕实验检测细胞迁移能力、Transwel1实验检测细胞侵袭能力,以探究MAGI1在RCC转移中的作用。4.为探讨MAGI 1介导的RCC上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的潜在分子机制,本研究通过免疫共沉淀鉴定PTEN/MAGIl/β-catenin复合物;通过免疫共沉淀鉴定Akt/GSK-3β信号通路和β-catenin信号通路相关分子的表达;进行TOP/FOP Flash测定以确定β-catenin信号通路的活化水平;通过免疫荧光检测评估β-catenin的表达水平。5.为了寻找RCC中MAGI1的潜在上游调控miRNA,从starBase、TargetScan和miRWalk三个生物信息数据库中预测筛选出了 20个可能靶向MAGI1的miRNAs。结合数据分析,预实验及文献复习情况,重点研究了 miRNA-520h,通过RT-qPCR验证miRNA-520h在RCC组织及其癌旁组织中的表达,并进一步分析MAGI1与miRNA-520h在RCC中表达水平的相关性。6.为了探讨在RCC中miRNA-520h的上游转录调控因子,通过PROMO和PuTmiRNA 1.0数据库预测到2个潜在上游转录因子,即NF1和c-Myb。通过RT-qPCR检测RCC及其配对癌旁组织中NF1和c-Myb表达的水平。通过PROMO预测c-Myb中与miRNA-520h的结合位点。染色质免疫共沉淀实验和荧光素酶实验证实c-Myb与miRNA-520h启动子活性关系。RT-qPCR进一步验证敲低c-Myb或过表达c-Myb与miRNA-520h表达水平的变化。7.统计分析:所有数据均用GraphPad Prism软件7.0表示为平均值±标准差或最小值至最大值。采用双侧t检验确定两组间差异的显著性。多组试验采用单因素方差分析和Bonferroni-Holm校正。使用双尾Spearman检验进行相关性分析。P≤0.05为差异有统计学意义。结果1.免疫组织化学及RT-qPCR检测结果显示RCC患者的肿瘤组织中MAGI1在蛋白水平及mRNA水平的表达均较癌旁组织显著降低;M1期的MAGI1表达明显低于T1-T2和T3-T4期RCC;Ⅲ-Ⅳ级RCC中MAGI1的表达水平显著低于其在Ⅰ-Ⅱ级RCC中的表达。MAGI1在RCC细胞786-0、A-498、OS-RC-2、ACHN、Caki-1、SKRC39中的表达水平显著低于其在正常肾小管上皮细胞HK2中的表达,而且,MAGI1在人ccRCC皮肤转移细胞株Caki-1中的表达最低,提示MAGI1的表达与RCC细胞转移能力呈负相关。免疫荧光染色进一步证实以上结果。MAGI1蛋白在RCC中的表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小及肿瘤类型未发现显著差异。TCGA数据库中的517例ccRCC的队列Kaplan-Meier生存分析显示,与MAGI1表达水平较高的ccRCC患者相比,水平较低的ccRCC患者总体生存时间较短。RCC中MAGI1表达水平显著降低,RCC TNM分期越高,MAGI1表达水平越低,MAGI1的低表达与预后不良相关。2.划痕实验结果显示,与对照组细胞相比,MAGI1敲低表达细胞(sh-MAGI1)的迁移能力显著增加,而MAGI1过表达细胞(LV-MAGI1)的迁移能力显著降低。Transwell侵袭实验表明,MAGI1的敲低促进细胞侵袭,而MAGI1的过表达降低侵袭潜力。此外,Western Blot检查EMT标志物的表达水平。E-cadherin在sh-MAGI1细胞中表达下调,而Vimentin的表达显著增加。MAGI1低表达介导RCC的上皮间质转化。以上结果表明,RCC中MAGI1表达下调可促进细胞侵袭和转移,而MAGI1过表达可抑制细胞侵袭和迁移;3.免疫共沉淀实验通过PDZ(PSD-95/Dlg-A/ZO-1)结构域结合证实PTEN和β-catenin都与MAGI1结合,并依据MAGI1的量的不同而变化。Western blot结果显示,β-catenin与MAGI1呈负相关,而PTEN则保持不变。然而,PTEN的敲低显著增加了 β-catenin的表达。此外,Western blot和免疫荧光测定显示,MAGI1 的敲低促进了 β-catenin 的核转位。Western blot 和 TOP/FOP-Flash 荧光素酶报告分析提示MAGI1的敲低激活了 β-catenin下游信号传导途径。相反,MAGI1的过表达抑制p-catenin信号传导途径。以上实验证实MAGI1通过调节PTEN/MAGI1/p-catenin复合物以抑制β-catenin信号通路的活化。4.生物信息学软件 starBase、TargetScan 和 miRWalk 分析发现 miRNA-520h可能靶向调控MAGI1的表达。RT-qPCR验证miRNA-520h在RCC组织中表达上调,MAGI1与miRNA-520h表达呈负相关。通过对star-Base的计算预测,确定miRNA-520h与MAGI1的推定结合位点。荧光素酶报告基因测定进一步验证,与MAGI1 mRNA的突变体3’UTR相比,miRNA-520h模拟物以剂量依赖性方式显著降低具有MAGI1 mRNA的野生型3’UTR的荧光素酶水平。Western blot证实miRNA-520h模拟物也显著降低RCC细胞系中MAGI1蛋白水平。另外,miRNA-520h模拟物显著增加β-catenin和Vimentin表达。总而言之,过表达miRNA-520h可降低MAGI 1的蛋白水平和mRNA水平。表明在RCC中,miRNA-520h靶向下调MAG1的表达水平。5.使用PROMO和PuTmiRNA 1.0预测miRNA-520h的上游转录调控因子,RT-qPCR检测RCC及配对癌旁组织中NF1和c-Myb表达的水平,肿瘤组织中NF1表达较低,而c-Myb表达明显高于癌旁组织。通过PROMO预测到c-Myb与miRNA-520h的结合位点。染色质免疫共沉淀实验和荧光素酶实验证实c-Myb增加miRNA-520h启动子活性。下调c-Myb可降低miRNA-520h的表达,而过表达c-Myb可增加miRNA-520h的表达。表明c-Myb通过与RCC中miRNA-520h启动子结合而促进miRNA-520h的转录活性。结论1.RCC中MAGI1表达水平显著降低,MAGI1低表达与临床预后不良相关。2.RCC中下调MAGI 1表达可促进RCC细胞侵袭和转移,而过表达MAGI 1可抑制RCC细胞侵袭和迁移。3.MAGI1通过调节PTEN/MAGI1/p-catenin复合物以抑制p-catenin信号通路。4.RCC 中,miRNA-520h 表达上调,MAGI1 是 miRNA-520h 的靶标,miRNA-520h靶向下调MAGI1的表达。5.c-Myb是miRNA-520h的上游转录调控因子,通过与RCC细胞中miRNA-520h启动子结合而促进miRNA-520h的转录。6.MAGI1可通过c-Myb/miRNA-520h/MAGIl信号通路介导RCC的转移。