目的:探讨中药海龙抗D-半乳糖诱导老年性骨质疏松作用及其机制。方法:1.采用UHPLC-ESI-QTOF-MS方法鉴定中药海龙甾体化合物成分;测定海龙甾体类化合物对D-半乳糖诱导衰老成骨细胞增殖及ALP活力的影响,筛选具有抗老年性骨质疏松活性成分。2.将3月龄雄性ICR小鼠分为空白对照组、D-半乳糖模型组、阿仑膦酸钠对照组、海龙低剂量组、高剂量组、雄烯二酮低剂量组、高剂量组。空白对照组腹腔注射等体积生理盐水,其余6组小鼠均腹腔注射D-gal溶液,给药剂量为150 mg/kg,复制衰老动物模型。阿仑膦酸钠组小鼠给药剂量为14mg/kg,每周灌胃给药一次;海龙低剂量组、高剂量组小鼠给药剂量为1g/kg、2g/kg（以生药计）,雄烯二酮低剂量组、高剂量组小鼠给药剂量为40mg/kg、80mg/kg,连续给药造模12周。采用Micro-CT方法检测小鼠股骨远端骨密度及骨小梁参数;ELISA法检测小鼠血清及胫骨匀浆骨转换指标:ALP、OCN、TRACP、CTX-I;比色法检测小鼠血清尿液钙磷及肌酐含量;检测小鼠血清及胫骨匀浆氧化相关生化指标:SOD、GSH、CAT、MDA;测定各组小鼠睾丸系数,检测小鼠血清睾酮含量及睾丸氧化相关生化指标:SOD、MDA。3.采用100 m M D-半乳糖给药造模48 h,制备成骨细胞衰老模型。以MTT法检测成骨细胞增殖,采用碱性磷酸酶染色及比色法测定成骨细胞ALP活力,检测成骨细胞酶SOD、CAT活力,流式细胞术检测成骨细胞ROS水平、线粒体膜电位、细胞凋亡率,western blot法检测成骨细胞AKT/FOXO1/SOD2通路相关蛋白及AR蛋白表达。4.采用雄激素受体拮抗剂比卡鲁胺构建成骨细胞雄激素受体拮抗模型,以MTT法测定成骨细胞活力,并结合western blot法检测细胞Bcl-2、Bax、AR蛋白表达,筛选合适的比卡鲁胺给药浓度;检测海龙及雄烯二酮给药组成骨细胞经AR拮抗后细胞活力、碱性磷酸酶活力、活性氧水平、线粒体膜电位、细胞凋亡率、AKT/FOXO1/SOD2通路蛋白表达、AR蛋白表达。结果:1.鉴定出中药海龙10种甾体类化合物:雄烯二酮、4-雄烯二醇、5α-雄烷二醇、4,6-胆固醇二烯-3-酮、5α-胆甾烷-3β-醇、4-胆甾烯-3-酮、胆甾-3,5-二烯、7-酮胆固醇、麦角甾醇、4-甲基-7-烯-胆甾醇,并筛选出具有抗骨质疏松作用的活性成分雄烯二酮。2.中药海龙及其活性成分雄烯二酮可明显提高D-gal诱导老年性骨质疏松小鼠骨密度,改善骨微结构破坏;显著提高骨形成标志物ALP、OCN水平,降低骨吸收标志物TRACP、CTX-I水平;降低血清尿液肌酐含量,改善肾脏功能,抑制钙磷等矿物质流失;显著提高机体SOD、CAT活力及GSH水平,降低脂质过氧化物MDA含量,减轻机体氧化应激损伤;减轻小鼠睾丸氧化损伤,提高血清睾酮含量,改善衰老小鼠性腺功能减退。3.海龙及雄烯二酮对D-半乳糖损伤成骨细胞的保护作用及机制:海龙及雄烯二酮可明显提高D-半乳糖损伤成骨细胞活力及ALP活力,并提高SOD、CAT、线粒体膜电位,降低ROS水平和细胞凋亡率,激活AKT/FOXO1/SOD2信号通路,促进AR蛋白表达。4.海龙及雄烯二酮对雄激素受体拮抗成骨细胞的影响:80μM的比卡鲁胺给药48 h后,AR表达显著抑制,可构建良好的成骨细胞雄激素受体拮抗模型;比卡鲁胺处理后,海龙给药组和雄烯二酮给药组成骨细胞活力、ALP活力、线粒体膜电位显著降低,ROS水平和细胞凋亡率显著升高,同时下调p-AKT、p-FOXO1、SOD2蛋白表达。结论:1.对中药海龙甾体类化合物进行抗老年性骨质疏松活性成分筛选,发现雄烯二酮能显著提高D-gal诱导衰老成骨细胞的细胞活力及ALP活力,是具有抗老年性骨质疏松潜在价值。2.海龙及其活性成分雄烯二酮可减轻D-gal诱导衰老小鼠机体氧化损伤,减缓性腺功能减退,改善肾脏功能减少矿物质流失,促进骨形成,抑制骨丢失,具有抗老年性骨质疏松的作用。3.海龙及其活性成分雄烯二酮可激活AKT/FOXO1/SOD2信号通路发挥抗氧化作用,上调成骨细胞AR表达,从而减轻D-gal诱导成骨细胞氧化损伤,发挥骨保护作用。4.成骨细胞AR拮抗可抑制AKT/FOXO1/SOD2信号通路,从而降低海龙及雄烯二酮对D-gal损伤成骨细胞的抗氧化作用。