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隐孢子虫病是一种呈全球分布的人兽共患寄生虫病,牛可感染多种类型隐孢子虫,主要包括安氏隐孢子虫、微小隐孢子虫、牛隐孢子虫和瑞氏隐孢子虫等,其中微小隐孢子虫感染最为广泛,犊牛感染后出现腹泻、营养不良等症状,且对人类健康危害最为严重。近年来随着养牛业的迅速发展,牛成为人患微小隐孢子虫病的主要来源,且目前尚无微小隐孢子虫的特效药物和疫苗,所以建立快速准确的牛微小隐孢子虫诊断方法,对畜牧业的发展和人类健康安全意义重大。近年来发现在微小隐孢子虫的卵囊中存在一种病毒,即为微小隐孢子虫病毒（Cryptosporidium parvum virus,CSpV1）,其在卵囊中存在稳定,且数量较多,可作为牛感染微小隐孢子虫的重要检测指标。本研究选用实验室制备保存的微小隐孢子虫病毒单克隆抗体作为捕获抗体,本实验制备的兔抗微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白多克隆抗体作为检测抗体,建立三种检测牛粪便样品的微小隐孢子虫感染免疫学诊断方法并进行对比分析,为今后牛微小隐孢子虫的动态监测提供参考。双抗夹心ELISA检测方法的建立:首先表达微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白,制备并纯化出兔抗微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白多克隆抗体,以微小隐孢子虫病毒5#单克隆抗体作为捕获抗体,HRP标记兔抗微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白多克隆抗体作为检测抗体,建立牛微小隐孢子虫感染双抗夹心ELISA检测方法。通过各项条件的摸索优化,确定微小隐孢子虫病毒单克隆抗体的最佳包被量为0.25μg/孔;待检粪便样品的最佳稀释度为1:4稀释;HRP标记兔抗微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白多克隆抗体的最佳稀释度为1:200;敏感度可达到1:160;选取牛安氏隐孢子虫感染阳性参照粪便样品和牛贾第虫感染阳性参照粪便样品进行特异性试验,结果未出现交叉反应;采用不同批次的酶标板进行批间和批内重复试验,测得批内重复变异系数小于6%,批间重复试验的变异系数小于9%;应用已建立的牛微小隐孢子虫双抗夹心ELISA方法,检测长春地区120份粪便样品,并与市售微小隐孢子虫双抗夹心ELISA试剂盒作为比较,本方法检测出6份阳性样品,阳性率为5%（6/120）,市售ELISA试剂盒检出4份阳性样品,阳性率为3%（4/120）。Dot-ELISA检测方法的建立:使用NC膜作为载体,利用微小隐孢子虫病毒5#单克隆抗体和HRP标记的兔抗微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白多克隆抗体建立牛微小隐孢子虫感染Dot-ELISA检测方法。确定粪便样品的最佳稀释比例是1:16;HRP标记微小隐孢子虫病毒多抗最佳稀释比例为1:500;微小隐孢子虫病毒单克隆抗体的最佳包被量0.5μg/片;敏感性为1:40;选用牛安氏隐孢子虫感染阳性参照粪便样品和牛贾第虫感染阳性参照粪便样品进行特异性试验,均无交叉反应。应用已建立的牛微小隐孢子虫感染Dot-ELISA检测方法,检测长春地区120份牛粪便样品,检测出6份阳性样品,阳性率为5%（6/120）。胶体金试纸条的制备:首先应用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,金颗粒标记微小隐孢子虫病毒5#单克隆抗体,检测线（T）滴加兔抗微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白多克隆抗体,质控线（C）滴加羊抗鼠抗体,制备牛微小隐孢子虫感染免疫胶体金试纸条。通过优化各项条件,确定加入4μL K2CO3（0.2mol/L）时为胶体金溶液最佳pH值;金标微小隐孢子虫病毒单抗的最佳标记量为6μg,检测线（T）微小隐孢子虫病毒多抗最佳包被量为0.5mg/mL;质控线（C）最佳包被量为0.25mg/mL;敏感性为1:64;选用牛安氏隐孢子虫感染阳性参照粪便样品和牛贾第虫感染阳性参照粪便样品进行特异性试验,均无交叉反应,重复性较好;稳定性试验结果显示试纸条在4℃保存时间较长,90d时仍可判定阳性样品。室温和37℃保存的试纸条在90d时已不能判定为阳性,保存期在60d时可判定阳性样品;应用已建立的牛微小隐孢子虫免疫胶体金试纸条检测长春地区120份牛粪便样品,本方法检测出6份阳性,阳性率为5%（6/120）。