细胞的自噬(autophagy)是近十年来生命科学领域一个新的研究热点,它是继凋亡(apoptosis)之后发现的另一种程序性细胞死亡方式。自噬现象可见于细胞正常的生长发育及其病理变化过程,在降解胞内蛋白、蛋白结构重建、清除废物、保持细胞内环境稳定等方面发挥着非常重要的作用。在阐释自噬发生机制方面,人们对于酒精的毒性作用与细胞自噬的关系,特别是对神经元的影响研究较少。在胚胎发育的关键时期遭受宫内酒精的暴露,会对胚胎神经系统的发育造成较为严重的损害。本课题通过建立妊娠期酒精暴露动物模型,模拟胎儿酒精综合征(Fetal Alcohol Syndrome, FAS)的发生,应用透射电子显微镜、免疫细胞化学染色及Western blotting等技术,对孕期酒精暴露后不同年龄段的仔鼠小脑浦肯野(Purkinje)细胞自噬现象进行系统的研究,结果如下：1.孕期酒精暴露影响仔鼠小脑Purkinje细胞的发育利用免疫细胞化学染色的方法,在对照组与模型组间对P7～P30年龄段仔鼠的Purkinje细胞发育的一般形态进行比较,结果显示酒精模型组较对照组Purkinje细胞在发育上存在着一般形态学上的差异,如皮质层变薄、细胞胞体变小、细胞排列混乱、树突分支减少、树突棘密度降低等,特别是高剂量酒精组变化更明显。这说明酒精暴露影响了子代小脑Purkinje细胞的发育,且有剂量依赖效应。2.透射电子显微镜观察证实孕期酒精暴露后Purkinje细胞自噬的发生一直以来,透射电子显微镜都是判断自噬发生的金标准。我们利用透射电子显微镜技术,观察对照组与模型组小脑Purkinje细胞胞质内微观结构变化,结果发现：酒精暴露后Purkinje细胞自噬作用明显增强。酒精模型组较对照组,特别是高剂量酒精组细胞胞质内,发现较多自噬体或自噬溶酶体样结构,并且其细胞器普遍存在如线粒体结构肿胀、线粒体嵴受损,高尔基体扁平囊扩张、大小泡结构崩解,粗面内质网扩张等情况。这一结果从微观结构证实孕期酒精暴露对子代小脑Purkinje细胞的发育产生不良影响,且诱导细胞自噬的发生。3.光镜观察和Western blotting蛋白检测Purkinje细胞自噬情况比较微管相关蛋白轻链3(MAPLC3)是编码自噬相关蛋白的重要基因,它被认为是自噬体膜上标志性蛋白。本研究利用免疫细胞化学染色的方法,MAPLC3荧光单标、与Calbindin荧光双标,光镜下观察Purkinje细胞自噬现象的发生,结果显示：P7、P14模型组自噬细胞数量(PAC)及自噬指数(PAI)明显多于对照组,高剂量酒精组多于低剂量组(P<0.01)；P30模型组与对照组间差别不明显(P>0.05)。对照组不同年龄点仔鼠随着年龄的增长,PAC及PAI随着年龄的增长逐渐增高(F=58.29,P<0.001)。Western blotting支持了光镜统计结果,半定量分析显示差异具有统计学意义(P<0.01)。这样的结果提示孕期酒精暴露能够诱导Purkinje细胞自噬的发生,且有剂量依赖性和长时程效应。4. Beclin-1对细胞自噬影响的正调控作用Beclin-1也是哺乳动物参与自噬的特异性基因,已经证实在哺乳动物中Beclin-1表达的上调能够刺激自噬的发生,是白噬重要的正调节因子。利用Beclin-1荧光单标、与MAPLC3荧光双标、与Calbindin荧光双标,结果显示：Beclin-1在酒精模型组与对照组间的表达情况比较与MAPLC3基本一致,二者在同一细胞中几乎呈重叠表达,MAPLC3在细胞核内仅有少量表达,Beclin-1不表达,也即是二者表达基本上成正相关。Western blot半定量分析支持光镜统计结果,差异具有统计学意义。这一结果提示酒精暴露导致Purkinje细胞自噬作用增强可能是通过酒精的有效成分乙醇或者代谢产物乙醛刺激了Beclin-1表达的上调,激活了自噬其它相关基因如MAPLC3的表达。总之,自噬是大自然赋予生命体一种独特的生理调节方式,在细胞更新换代、抵御恶劣环境变化中起着非常重要的作用。通过本课题的研究将使我们进一步认识到母体滥用酒精所产生的胎儿酒精综合征的危害,尤其是对胎儿和儿童中枢神经系统发育的影响,以及对解释由于酒精毒性作用所引起的相关神经系统疾病如韦尼克(Wernicke)脑病、酒精性小脑变性等的发病机理都具有重要意义。对于提高国人体质、促进优生优育有巨大的社会效益,对发育神经生物学、神经病学及神经毒理学有一定的理论价值。