目的:钙化性主动脉瓣膜疾病（Calcifiedaorticvalvedisease,CAVD）是一种常见心脏瓣膜病,在我国老年人口中具有较高的发病率。研究表明,CAVD由内皮损伤、脂质浸润、慢性炎症、细胞成骨分化等一系列复杂变化引起,涉及不同类型的细胞间相互作用,然而各类型细胞在CAVD疾病进展中的具体功能机制尚不明确。瓣膜内皮细胞（Valvular endothelial cells,VECs）损伤是瓣膜钙化的始发因素。既往研究表明,VECs 的内皮-间质细胞转化（Endothelial-to-Mesenchymal transition,EndMT）与瓣膜钙化密切相关,VECs的异质性以及不同VECs亚群在EndMT过程中发挥何种功能尚缺乏深入研究。钙化的瓣膜中存在大量免疫细胞浸润,目前研究主要关注巨噬细胞对CAVD的影响,而其他类型免疫细胞对CAVD作用的研究较少,因此需进一步研究其他类型免疫细胞对CAVD的作用。瓣膜间质细胞（Valvular interstitial cells,VICs）在主动脉瓣中细胞数目最多,且在CAVD进展过程中,正常瓣膜中静息状态的VICs被异常激活,转化为肌成纤维样VICs,经过炎症等因素的刺激,最终转化为成骨样VICs,导致瓣膜钙化。瓣膜内VICs具有较高的异质性,因此解决VICs的异质性问题,阐明不同VICs亚群对CAVD的作用至关重要。方法:本研究利用来自公共数据库的人主动脉瓣膜的单细胞转录组测序数据进行分析。使用SeuratR包对细胞进行聚类分群,鉴定样本间差异表达基因;利用经典的标记基因鉴定主要的细胞类型;通过Metascape在线分析工具进行GO富集分析;利用ESTIMATE软件分析单细胞转录组测序数据与常规转录组数据中样本的基质评分和免疫评分,评估样本中基质细胞和免疫细胞浸润;使用SCENIC预测细胞亚群的转录因子活性;利用Monocle2软件进行单细胞拟时间分析,研究细胞亚群的分化轨迹;使用CellChat R包进行细胞通讯分析,预测细胞间相互作用;收集正常主动脉瓣膜组织的临床样本,分离培养原代VICs细胞,对VICs给予Midkine（MDK）干预,茜素红S染色检测VICs中钙结节形成情况,通过RT-qPCR和Western blot检测成骨分化关键基因和蛋白的表达水平,最后进一步对MDK主要作用的信号通路进行体外实验验证。结果:①本研究从12776个细胞中鉴定出16275个基因,3366个细胞（26%）来自正常样本,9410个细胞（74%）来自钙化样本。②主动脉瓣中共鉴定出三种主要的细胞类型:VICs、VECs和免疫细胞。其中瓣膜中VICs细胞含量最多,比例高达89.9%。③来自钙化和正常瓣膜样本中的VICs、VECs和免疫细胞具有不同的基因表达模式。GO富集分析显示在钙化样本中VICs主要参与细胞外基质重塑过程,VECs主要参与代谢相关过程,免疫细胞主要参与白细胞激活介导的免疫相关过程。④与正常瓣膜样本相比,钙化瓣膜样本的基质评分和和免疫评分显著升高。⑤瓣膜中的免疫细胞主要包括巨噬细胞、T细胞和树突状细胞,分别受到不同转录因子调控。GO富集分析显示巨噬细胞和树突状细胞参与白细胞激活相关过程,T细胞参与细胞外基质重塑过程。此外本研究首次发现T细胞同样可存在于正常人的瓣膜组织中。⑥VECs分为三个细胞亚群:正常来源的瓣膜内皮细胞（Normal-derivedvalvular endothelial cells,nVECs）、钙化来源的瓣膜内皮细胞（Calcified-derivedvalvular endothelial cells,cVECs）,以及过渡态的瓣膜内皮细胞（Transitional valvular endothelial cells,tVECs）。tVECs是EndMT过程中间过渡类型。⑦通过对VICs的进一步分析明确了VICs高度的异质性,并对6种不同VICs亚群的功能进行分析和总结。⑧细胞通讯结果表明,基质瓣膜间质细胞（Matrix valvular interstitial cells,mVICs）是最具特异性的 VICs 亚群,mVICs 释放 MDK,以旁分泌的方式影响其他VICs亚群,并通过体外实验证实MDK可以通过抑制Notch信号通路发挥抑制VICs钙化的作用。结论:本研究基于单细胞转录组测序数据研究了主动脉瓣细胞的异质性,鉴定出主动脉瓣中主要的细胞亚群,描绘了各细胞亚群间的相互作用,并通过实验验证MDK可以通过Notch信号通路抑制VICs钙化。