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研究目的:结肠癌是发病率及死亡率均较高的实体肿瘤之一,中期结肠癌患者5年生存率不足60%,晚期结肠癌患者5年生存率几乎为0。目前,治疗结肠癌的主要手段包括手术、化疗合放疗等,在一定程度上能够控制结肠肿瘤的生长,然而细胞恶性程度高,易发生复发、转移和耐药的中晚期结肠癌患者预后不佳。基于程序性死亡受体1（PD-1）及其配体PD-L1的免疫检查点阻断疗法为肿瘤患者带来新的希望。但大多数人对此免疫疗法不敏感,最主要的原因是不同肿瘤细胞中PD-1/PD-L1表达量不一致以及肿瘤微环境中T细胞浸润不足。工程菌S.ΔppGpp FlaB（减毒鼠伤寒沙门氏菌分泌鞭毛蛋白B）通过增强M1型巨噬细胞的极化来有效治疗肿瘤。我们推测其可能还具有改善肿瘤微环境（如促进T细胞浸润）的作用。因此,本研究从S.ΔppGpp FlaB与PD-1抗体联合用药治疗肿瘤入手,探究基因工程菌S.ΔppGpp FlaB和PD-1抗体联合用药对肿瘤治疗的效果及机制,为细菌介导的肿瘤免疫治疗与免疫检查点抑制剂协同作用的研究提供依据。研究方法:我们通过生物信息学分析了Gene Expression Omnibus数据库人结肠癌单细胞测序数据;构建了生物发光菌株S.ΔppGpp FlaB lux,用小动物活体成像系统在第2、第4、第6、第8、第10天检测S.ΔppGpp FlaB lux组和S.ΔppGpp FlaB lux+PD-1抗体组荷瘤小鼠体内菌株的存活情况;建立了小鼠结肠癌细胞CT26、人结肠癌细胞HT-29、人肝癌细胞Hep G2和人胃癌细胞HGC-27皮下荷瘤小鼠模型,研究S.ΔppGpp FlaB与PD-1抗体联合用药的体内抗肿瘤作用;对给药后的小鼠肿瘤样本进行转录组测序和生物信息学分析;蛋白免疫印迹（Western blotting,WB）验证PD-L1、PD-1、p-PD-1的表达;q RT-PCR验证CD8+、CCL4、CXCL10的表达;免疫荧光切片检测肿瘤内PD-1和PD-L1的表达,以及M1/M2型巨噬细胞、树突状细胞（DC）和T细胞的浸润情况;流式细胞仪检测荷瘤小鼠外周血白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素10（IL-10）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和γ干扰素（IFN-γ）的含量;组织病理学检查荷瘤小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等主要生命脏器和肿瘤组织;WB检测PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT的表达,分析对PI3K/AKT信号通路的影响。研究结果:与癌旁组织相比,结肠癌肿瘤微环境中缺乏树突状细胞、CD8+T细胞、B细胞和自然杀伤（NK）细胞,结肠癌肿瘤组织和癌旁组织均含有巨噬细胞且数量相当;S.ΔppGpp FlaB lux组和S.ΔppGpp FlaB lux+PD-1抗体组荷瘤小鼠体内实体瘤均能检测到菌体存活,且发光值差异无统计学意义;在CT26、HT-29、Hep G2和HGC-27 4种荷瘤小鼠模型中,联合给药组均能有效抑制肿瘤的生长,与PD-1抗体和S.ΔppGpp FlaB单独给药组比较,差异均具有显著统计学意义,p＜0.01;与PD-1抗体给药组比较,联合给药组有2546个基因上调和1808个基因下调,主要涉及癌症和PI3K/AKT信号通路;与PD-1抗体组比较,S.ΔppGpp FlaB+PD-1抗体组的PD-L1、PD-1、p-PD-1、CD8+、CCL4、CXCL10的表达均上调且差异均具有统计学意义,但S.ΔppGpp FlaB和S.ΔppGpp FlaB+PD-1抗体组之间的差异无统计学意义;与PD-1抗体组比较,S.ΔppGpp FlaB+PD-1抗体组明显增加PD-1和PD-L1的表达以及M1型巨噬细胞、DC细胞和T细胞的浸润,但S.ΔppGpp FlaB和S.ΔppGpp FlaB+PD-1抗体组之间无统计学意义;与PD-1抗体组比较,S.ΔppGpp FlaB+PD-1抗体组的IL-10、MCP-1、TNF-α和IFN-γ含量明显增加;实验各组中荷瘤小鼠的心脏、脾脏、肺脏和肾脏组织病理学检查未见异常,S.ΔppGpp FlaB和S.ΔppGpp FlaB+PD-1抗体组中荷瘤小鼠的肝脏出现肝小叶周边和结肠癌肿瘤组织出现多灶性、桥接状细胞坏死;与PD-1抗体组比较,S.ΔppGpp FlaB+PD-1抗体组的p-PI3K和p-AKT表达均显著下调。研究结论:S.ΔppGpp FlaB可改善肿瘤免疫微环境,促进CD8+T细胞的浸润,同时促进PD-1和PD-L1的表达,进而增强肿瘤对PD-1抗体的敏感性。此外,S.ΔppGpp FlaB可以通过抑制PI3K和AKT的磷酸化来调控PI3K/AKT信号通路,进而抑制肿瘤生长。本研究可为细菌免疫治疗提供新的思路,为临床中使用合成生物学手段的可能性奠定基础,为细菌和基于PD-1免疫检查点阻断剂联合治疗肿瘤提供新的参考。