【摘 要】
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H5N6亚型禽流感病毒（AIVs）不仅在全球许多国家和地区的野鸟和家禽中广泛流行和传播,而且自2014年首次感染人以来,H5N6亚型AIVs在全球共造成52人感染,26人死亡。国家禽流感参考实验室的长期研究表明,H5N6亚型AIVs对哺乳动物的致病力呈现明显的多样性,部分病毒对哺乳动物呈现高致死能力。因此,了解和深入探讨H5N6亚型AIVs引发哺乳动物致病的分子机制对于该病毒可能引起的人间流感大流
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H5N6亚型禽流感病毒（AIVs）不仅在全球许多国家和地区的野鸟和家禽中广泛流行和传播,而且自2014年首次感染人以来,H5N6亚型AIVs在全球共造成52人感染,26人死亡。国家禽流感参考实验室的长期研究表明,H5N6亚型AIVs对哺乳动物的致病力呈现明显的多样性,部分病毒对哺乳动物呈现高致死能力。因此,了解和深入探讨H5N6亚型AIVs引发哺乳动物致病的分子机制对于该病毒可能引起的人间流感大流行的预警和防控指导具有重要的意义。本研究选取了两株遗传背景相似、但对小鼠的致病力具有显著差异的H5N6亚型AIVs——A/duck/Guangdong/S1330/2016（H5N6）（简称GD/330）和A/environment/Fujian/S1160/2016（H5N6）（简称FJ/160）作为研究对象,以开展H5N6亚型AIVs对哺乳动物致病力差异的分子机制研究。其中,GD/330在小鼠体内表现为高致病力,其MLD50为2.5 log10EID50;而FJ/160在小鼠体内表现为低致病力,其MLD50为7.4 log10EID50,具体研究内容如下:本研究利用反向遗传操作技术,以GD/330为骨架救获了一些列重组病毒和突变病毒,同时以小鼠为模型评价了这些毒株的致病力。结果表明,当引入FJ/160的HA基因节段后,GD/330-FJ/160HA的致病力较r GD/330减弱了大约1000倍,说明HA基因是减弱GD/330在小鼠体内致病力的关键基因节段。进一步的研究表明,HA基因的G225W氨基酸突变使r GD/330的致病力减弱了大约631倍,说明HA基因第225位点的氨基酸是导致两株H5N6亚型AIVs在小鼠体内致病力差异的关键氨基酸位点。体外复制动力学结果表明,GD/330-HA-G225W在A549细胞中同一时间点的复制滴度较r GD/330明显降低,说明HA基因的G225W氨基酸突变减弱了H5N6亚型AIVs在哺乳动物细胞中的复制能力。多核体的形成实验结果表明,r GD/330和r FJ/160 HA蛋白激活的p H分别为5.5和5.9,GD/330-HA-G225W HA蛋白激活的p H为5.7,说明HA基因的G225W氨基酸突变升高了H5N6亚型AIVs HA蛋白激活的p H。测定病毒的稳定性后发现,GD330-HA-G225W的稳定性与r GD/330差异显著,说明HA基因的G225W氨基酸突变降低了H5N6亚型AIVs的酸稳定性和热稳定性。HA蛋白的结构预测表明,甘氨酸是最小的氨基酸,以氢原子作为其侧链;而色氨酸是最大的氨基酸,以吲哚作为其侧链。因此,不同的空间位阻可能是导致两株H5N6亚型AIVs的HA蛋白功能不同的原因。综上所述,本研究阐明了HA基因第225位点的氨基酸是导致两株H5N6亚型AIVs在小鼠体内致病力差异的关键氨基酸位点。HA基因的G225W氨基酸突变通过升高GD/330 HA蛋白激活的p H以及降低GD/330的酸稳定性和热稳定性,从而减弱了H5N6亚型AIV在小鼠体内的致病力。本研究为H5亚型AIVs的疫苗和抗病毒药物的研发提供了参考依据。
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