A型流感病毒是造成上呼吸道感染的重要原因之一,可以引起严重的急性呼吸道疾病,全球每年因A型流感病毒感染导致的死亡病例数以万计,对公共卫生安全造成不可估量的损失。禽流感是由A型流感病毒引起的人畜共患传染病,可在禽类与人之间传播。目前,针对A型流感病毒的防控措施主要是疫苗和药物,但是流感病毒能够通过不断的变异进化获得抗药性,为了对抗病毒的这一特性,我们需要探索新的宿主蛋白来针对禽流感病毒。由于流感病毒复制周期中的每个阶段都需要宿主因子参与,因此,靶向病毒复制至关重要的宿主因子的筛选和鉴定可以为流感病毒的防治提供新的药物靶点。抗病毒宿主因子筛选工作的重要步骤是选择合适的筛选策略,CRISPR/Cas9是从许多细菌和古菌物种中存在的抗病毒免疫机制中改造而来,相比于RNAi、ZFN、TALEN等基因组编辑工具,CRISPR/Cas9具有成本低、不易脱靶、易制备和保存、DNA水平敲除也更彻底等特点。该筛选策略所选用的A549细胞系是改造过的人肺上皮细胞,可以稳定表达CRISPR/Cas9核酸酶,同时还融合表达cop GFP和潮霉素抗性基因,可以高效的进行宿主基因筛选工作。本试验首先利用CRISRP/Cas9技术筛选优化了一株A549细胞系,该细胞系具有很高的Cas9切割活性,可广泛应用于体外基因敲除、转基因敲入、诱变、转基因整合或其他与CRISRP/Cas9基因组编辑相关的应用研究。接着通过慢病毒系统成功包装了人基因组慢病毒敲除文库,该慢病毒文库感染效率高,可以高效的用于大规模筛选工作。利用该慢病毒文库成功构建包含人全基因组单基因缺失A549细胞文库,该文库为不同亚型流感病毒相关宿主因子的筛选工作奠定了基础。本试验利用一株H5N1高致病性禽流感病毒结合全基因组CRISPR敲除筛选的方法,确定了流感病毒入侵宿主细胞的关键宿主因子IGDCC4进行进一步研究。该宿主因子此前并未有与病毒或免疫相关的研究报道。本研究发现,H5N1病毒在IGDCC4基因缺失的A549细胞中的复制水平明显降低。为了确定流感病毒复制周期的哪个阶段受到IGDCC4的影响,我们用H5N1病毒分别感染IGDCC4基因缺失细胞和对照A549细胞,并在2、4、6和8小时后用q RTPCR测量细胞中病毒NP基因的v RNA和m RNA水平。在这四个时间点,IGDCC4基因缺失细胞中病毒的两种RNA的水平都明显低于对照A549细胞中的水平。在病毒感染后2小时,即病毒生命周期的早期阶段,细胞中的v RNA主要来自于感染病毒而不是子代病毒,在这个时间点,IGDCC4基因缺失细胞中较低的v RNA水平表明宿主因子IGDCC4很可能参与了病毒生命周期的早期阶段。为了确定IGDCC4参与IAV复制的具体阶段,我们首先利用激光共聚焦实验确定IGDCC4缺失后,影响了病毒在细胞内感染的早期阶段。随后通过细胞流式实验和Western blot实验发现,IGDCC4缺失的A549细胞表面的唾液酸受体表达以及病毒在基因缺失细胞表面的吸附均没有差异。但是,IGDCC4缺失的细胞表面附着的病毒在内化过程中通过PBS-HCL（p H=1.5）缓冲液洗脱而去除,从而导致被感染细胞内化的病毒NP水平大大降低,在IGDCC4缺失细胞中过表达IGDCC4可以恢复对病毒的内吞作用。另外,通过CO-IP实验,我们发现IGDCC4的胞外区与IAV的HA蛋白存在相互作用,并且通过激光共聚焦共定位实验进一步确定了其相互作用。以上结果显示,IGDCC4是IAV入侵宿主细胞的重要因子,主要影响病毒的内化阶段。同时VSV病毒和转铁蛋白实验结果证明IGDCC4影响的内吞作用具有病毒特异性。此外,本研究建立了IGDCC4基因敲除小鼠模型,H5N1病毒感染小鼠实验发现与野生型小鼠相比,IGDCC4基因敲除小鼠体重下降不明显且部分存活,而野生型小鼠全部死亡,病毒在基因敲除小鼠鼻甲和肺脏中复制滴度显著降低。实验结果表明,IGDCC4基因敲除小鼠对H5N1病毒感染的抵抗力增强。本研究除了鉴定出新的宿主因子IGDCC4外,也筛选到了已经报道的参与流感病毒复制的宿主因子SLC35A1和ST3GAL4,证明了本实验筛选的可靠性。综上所述,本研究证明了IGDCC4在IAV入侵宿主细胞的步骤中起关键作用,定义了其参与病毒复制的关键阶段,本研究证明CRISPR/Cas9筛选是发现细胞内病原体各个复制阶段所必需的宿主因子的可靠工具,并为鉴定宿主靶向药物发展提供了理论基础。