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【研究目的】高尿酸血症及痛风的流行在全球范围内逐渐增加,近年来我国高尿酸血症及痛风发病率直线上升,部分地区痛风发病已接近欧美人群,这可能与我国经济发展、人们生活方式和饮食结构改变有关。红肉、海鲜、酒精和果糖的摄入量与高尿酸血症和痛风风险呈正相关。众所周知,大量嘌呤摄入是痛风急性发作最常见诱因。外源嘌呤化合物主要经肝脏代谢氧化分解为终产物尿酸。黄嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidoreductase,XOR）是嘌呤分解代谢过程中尿酸生成限速酶。XOR表达及活性异常都会导致尿酸水平升高,增加痛风发病风险。XOR通常被认为是治疗痛风和高尿酸血症的药物靶点。XOR抑制剂如别嘌呤醇、非布索坦,用于降低血尿酸水平是临床治疗痛风的常规药物。动物实验研究证实,高尿酸血症大鼠肝脏XOR表达及活性均显著升高。然而,XOR表达及活性异常的诱因并不清楚。通常在机体代谢过程中,底物过量会诱导其催化酶表达增加,因此,本研究最初推测嘌呤作为代谢底物,过量摄入可能直接诱导肝脏XOR表达增加。然而,结果出乎意料,过量的嘌呤虽然能够促使尿酸生成增加,却并不能直接诱导XOR的表达增加。饮食炎症指数DII（Dietary Inflammatory Index）是用来评估饮食促炎潜力的评分机制。红肉、海鲜、酒精、果糖的摄入量不仅与高尿酸血症和痛风的风险呈正相关,同时与机体慢性炎症关系密切,提示高嘌呤的饮食结构不仅增加尿酸水平,很可能与机体炎症密切相关。实际上,炎症状态和尿酸水平之间的因果关系并没有统一定论。尿酸水平升高究竟是炎症状态的一种表征,还是导致系统性炎症的诱因并不清楚。有学者猜测,高尿酸与全身性炎症的关系可能与一个单独的中介系统有关,它既驱动炎症,又增加血清尿酸水平。因此,我们推测嘌呤除了作为代谢底物生成尿酸,还可能通过饮食炎症机制调控尿酸生成,从而参与高尿酸血症发病分子机制。经实验验证发现,大量嘌呤可以诱导淋巴细胞IFN-γ表达增加,嘌呤通过IFN-γ介导间接上调XOR表达,促进尿酸生成。炎症细胞因子（如IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ）通过上调XOR表达,促进尿酸生成,在肺内皮细胞、乳腺细胞、肾内皮细胞和中性粒细胞等多种组织类型细胞中被报道,其中尤以IFN-γ激活XOR蛋白表达最为明显。然而,IFN-γ诱导XOR表达机制并没有深入研究,炎症细胞因子是否影响肝细胞XOR表达也未见报道。JAK/STAT作为IFN-γ激活的经典信号通路,在代谢、炎症及肿瘤等多种疾病中被激活。有研究报道,饮食诱导的高尿酸大鼠模型中,JAK/STAT通路被激活,而抑制JAK/STAT通路可有效改善肾脏尿酸排泄,缓解高尿酸所致肾脏损伤,提示JAK/STAT信号通路可能参与血尿酸调控。因此,本研究利用细胞因子刺激肝细胞,探究其是否影响肝细胞XOR表达以及尿酸产生,以及其可能的作用信号通路。本文针对高嘌呤摄入诱发血尿酸升高的分子机制进行研究,旨在探讨外源性嘌呤摄入过高是否直接诱导催化酶XOR表达增加,以及嘌呤摄入是否通过影响机体炎症状态间接调控XOR表达,从而加剧尿酸生成。本研究期望为嘌呤及XOR参与高尿酸血症发病提供直接证据,为高尿酸血症的发病机制研究提供新的思路,可能为预防和治疗高尿酸血症和痛风提供理论基础。【材料与方法】1.黄嘌呤（Xanthine,Xan）、次黄嘌呤（Hypoxanthine,hXan）不同浓度、时间处理Hep G2、Bel-7402细胞,检测尿酸生成量,探究高嘌呤摄入对肝细胞尿酸生成的影响;2.Xan、hXan处理Hep G2、Bel-7402细胞,通过Real-time quantitative PCR（q PCR）及Western blotting（WB）检测黄嘌呤氧化酶（XOR）m RNA及蛋白表达水平,探究过量嘌呤是否诱导XOR表达;利用XOR酶活性检测试剂盒,检测XOR活性变化,探究高嘌呤摄入是否影响XOR酶活性;3.Xan、hXan处理Jurkat细胞,检测IL-1、IL-6、IFN-γ表达,探究嘌呤是否影响几种细胞因子表达;4.Xan、hXan处理Jurkat细胞,利用非接触式共培养方法,将Jurkat细胞培养液加入肝细胞培养体系中,检测Hep G2、Bel-7402细胞XOR表达及尿酸生成,探究嘌呤诱导淋巴细胞因子产生,是否影响肝细胞XOR表达和尿酸生成;5.人重组IL-1、IL-6、IFN-γ处理Hep G2、Bel-7402细胞,检测XOR蛋白表达、XOR酶活性及尿酸生成,验证IL-1、IL-6、IFN-γ是否诱导肝细胞XOR表达及活化并促进尿酸生成;6.IFN-γ诱导XOR表达升高的机制研究:通过人重组IFN-γ刺激Hep G2细胞,并利用si RNA敲降STAT1表达,检测XOR表达情况,验证IFN-γ是否通过JAK/STAT1信号通路上调XOR表达;7.转录因子预测发现IRF1是XDH（XOR编码基因）潜在转录激活因子,通过Ch IP-q PCR分析STAT1、IRF1和CBP,在XDH启动子区结合情况;利用Co-IP验证STAT1、IRF 1、CBP是否存在直接相互作用共同参与调控XOR表达;8.收集高尿酸血症患者及正常对照人群血液样本,检测血尿酸、嘌呤及IFN-γ含量,分析IFN-γ与嘌呤、尿酸相关性,进一步验证高尿酸血症可能与机体炎症相关。【实验结果】1.外源嘌呤刺激肝细胞尿酸生成增多,但不影响XOR表达及活性;2.外源嘌呤诱导T淋巴细胞IFN-γ表达增加,并促进肝细胞XOR表达及尿酸生成;3.IFN-γ刺激肝细胞激活JAK/STAT1信号通路上调XOR表达及活性,继而促进尿酸生成;4.IFN-γ激活JAK/STAT1信号通路,转录因子STAT1活化并与IRF1协同作用进一步招募CBP,共同参与XDH转录调控;5.高尿酸血症患者血尿酸与嘌呤、IFN-γ存在正相关关系。【结论】众所周知,外源性嘌呤主要由肝脏代谢生成尿酸。在这里,我们提供了新的体外证据,过量的嘌呤并不直接促进人肝细胞中XOR的表达,而是作用于淋巴细胞,促进IFN-γ的产生和释放,从而激活肝细胞JAK/STAT1通路,活化的STAT1与IRF1结合于XDH启动子协同招募CBP共激活XDH转录,上调XOR表达,从而提高尿酸的产生。嘌呤不仅作为代谢底物生成尿酸,同时能够诱导机体炎症反应,进一步促进尿酸生成,这可能是外源嘌呤参与高尿酸血症发病分子机制之一。