【摘 要】
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目的:幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）感染人体后可引起人类多种胃肠道疾病,例如消化性溃疡、胃癌等。全世界有半数以上的人口H.pylori感染阳性,世界卫生组织于1994年将其定为I类致癌物。中性粒细胞是人体中占有重要地位的抗感染免疫细胞,在杀灭病原体后自身也随之死亡。H.pylori感染后可引起胃粘膜中性粒细胞的浸润,通过异常释放炎症因子而加剧感染部位的炎症反
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目的:幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）感染人体后可引起人类多种胃肠道疾病,例如消化性溃疡、胃癌等。全世界有半数以上的人口H.pylori感染阳性,世界卫生组织于1994年将其定为I类致癌物。中性粒细胞是人体中占有重要地位的抗感染免疫细胞,在杀灭病原体后自身也随之死亡。H.pylori感染后可引起胃粘膜中性粒细胞的浸润,通过异常释放炎症因子而加剧感染部位的炎症反应,且感染部位的胃粘膜受损程度与此处的中性粒细胞浸润程度成正比例关系。但目前鲜有关于H.pylori感染部位浸润的中性粒细胞死亡机制的研究。本文以H.pylori标准菌株NCTC11637和中性粒细胞为研究对象,通过体外共培养技术、流式细胞术、酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹法等方法对中性粒细胞感染H.pylori后的死亡机制进行了探求,以期阐明H.pylori感染的中性粒细胞的死亡信号通路,为H.pylori所致胃十二指肠疾病的预防与治疗提供新的理论依据和实践指导。方法:1.H.pylori与中性粒细胞体外共培养体系的建立:培养H.pylori的标准株NCTC11637,并采用微生物质谱检测系统和革兰染色法对其进行鉴定验证;采集健康成人志愿者外周血（肝素锂抗凝）15m L,通过密度梯度离心法进行中性粒细胞的分离纯化,利用流式细胞术和瑞氏-吉姆萨染色法对分离的细胞进行纯度检测;2.H.pylori与中性粒细胞共培养后,进行中性粒细胞形态、凋亡率、细胞因子改变的分析:采用瑞氏-吉姆萨染色法分析共培养后H.pylori对细胞形态的影响;采用流式细胞术分析共培养体系中细胞凋亡的情况;采用流式细胞术和酶联免疫吸附测定分析共培养上清液中多种细胞因子的变化情况;3.H.pylori与中性粒细胞共培养后,通过Western blot进一步分析H.pylori介导的中性粒细胞凋亡障碍机制研究。结果:1.成功构建H.pylori与中性粒细胞体外共培养体系:培养、鉴定H.pylori标准菌株NCTC11637并分离人体外周血中性粒细胞成功,且细胞分离纯度达到96.6%,并确定了共培养体系中细胞与H.pylori共培养的最佳浓度为1:10。2.通过瑞氏-吉姆萨染色,显微镜下观测H.pylori与中性粒细胞体外共培养后中性粒细胞形态的变化,结果发现共培养的中性粒细胞在形态上表现出核分叶偏多、体积变大、与对照组的体积缩小、核固缩呈圆球状的特征明显不同;流式细胞技术—PS分子外翻（Annexin V染色）和PI染色阳性检测了共培养体系中中性粒凋亡的情况,结果显示与对照组相比,H.pylori感染抑制了中性粒细胞的Annexin V阳性细胞增高趋势;且体外共培养体系中细胞因子与对照组相比,体外共培养体系中的中性粒细胞释放的IL-6、TNF-α、IL-1β明显增加;3.利用Western blot,检测促凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-8、Bax,抗凋亡蛋白Bcl-x L和作为中性粒细胞“存活信号”蛋白Akt的表达及活化水平,与对照组相比,H.pylori感染的中性粒细胞中:Bax（促凋亡蛋白）的表达降低,同时同为促凋亡蛋白的Caspase-3、Caspase-8的活化部分表达也降低,而中性粒细胞“存活信号”蛋白Akt、抗凋亡蛋白Bcl-x L表达水平增高,总Caspase-3、Caspase-8的表达程度也升高;结论:1.成功构建H.pylori与中性粒细胞体外共培养体系。2.体外共培养体系中的细胞凋亡的形体变化特征与正常细胞凋亡形态变化不一致,H.pylori感染可以诱导中性粒细胞凋亡进程障碍,且共培养体系中H.pylori促进了中性粒细胞释放IL-6、TNF-α、IL-1β增多。3.H.pylori在感染人中性粒细胞后,既能抑制细胞凋亡的外源性途径（死亡受体途径）中促凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-8活化部分的表达;同时又上调抗凋亡蛋白Bcl-x L、下调促凋亡蛋白Bax的表达来抑制细胞凋亡的内源性途径（线粒体途径）的作用,最终使细胞凋亡进程发生障碍,延长了中性粒细胞生存周期。
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