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枇杷是一种原产于中国的常绿果树,因其果实酸甜爽口、营养价值高,果实和叶片均具有药用价值而备受消费者喜爱,但随着枇杷产业区域规模日益明显,病虫害问题也凸显出来,成为了农民增收的重大障碍。在2016～2019年,课题组前期对全国多个产区开展了田间病害调查,其中由根腐病造成的“死棵”现象引起了关注。该病害在各产区均有不同程度发生,福建和浙江产区尤甚,重病地块病株率在25%以上。该病害症状包括地上部分叶片发黄萎蔫,地下部分主根腐烂,侧根开裂断损,最终导致落叶和死亡。由于根腐病是土传病害,待植株显症后已错过最佳治疗时机,目前种植抗病品种和轮作是大田作物最有效又环保的防控措施,但针对轮作操作困难的多年生果树,明确其病原菌种类及其侵染特性是抗根腐病育种的首要任务。鉴于此,本研究以枇杷根腐病为研究对象,通过传统分离鉴定法（形态学、多基因联合、致病性分析）,明确枇杷根腐病病原菌种类,并分析其生长特性;利用PEG介导法建立枇杷根腐病菌原生质体遗传转化体系,并筛选与野生型致病性一致、稳定表达的GFP标记菌株,对其在枇杷植株体内进行定殖示踪;通过设计枇杷根腐病菌的荧光定量特异性引物,采用实时荧光定量PCR技术,建立枇杷根腐病菌的定殖量检测体系;利用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）检测枇杷根腐菌侵染后枇杷内源激素的变化,并利用实时荧光定量PCR技术分析激素信号途径相关基因的表达情况。主要研究工作及结果如下:1.利用组织分离法对采自浙江、福建和重庆产区的18份病根样品（共90个组织块）进行分离,从中共获得82个单孢菌株;基于ITS序列初步分析发现其隶属于镰孢属（Fusarium sp.）和木霉属（Trichoderma sp.）,分离频率分别为89.02%和10.98%,镰孢属为优势菌属;依据柯赫氏法则,进一步从优势菌属中鉴定到2个种,即尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum和腐皮镰孢菌Fusarium solani,并对其代表菌株Root1和Root2进行了形态特征描述、多基因序列系统发育树构建和致病性分析。结果表明,在PDA上培养7d时Root1菌落正面菌丝呈白色绒毛状,背面产生粉色或紫粉色色素,大分生孢子镰刀形,两头稍尖,具有3～7隔,小分生孢子圆形或椭圆形,在感病叶片上观察到簇状、透明的分生孢子座;Root2菌落正面菌丝呈白色棉絮状,背面白色至淡黄色;大分生孢子镰刀型,稍弯曲,多为1～5隔,小分生孢子椭圆形或肾形,菌丝基部具长圆柱形单瓶梗;基于ITS,EF1-α和RPB2三个基因联合序列构建的系统进化树显示,Root1与本研究中的分离菌株Root3、Root6和F.oxysporum模式菌株NRRL25387聚在一起,Root2与来源于不同数据库的4个F.solani的参考菌株聚在同一分支中,outgroup均独立在外,形成单独分支。此外,进化树各分支节点贝叶斯后验概率和置信度大多高于80%,能够准确反映各菌株的亲缘关系;利用离体刺伤接种叶片和活体伤根接种幼苗法进行致病性测定,结果显示,枇杷叶片、幼苗在接种Root1、Root2后均可发病,病症表现与其田间症状基本一致,对发病叶片进行病原菌分离,经形态学、分子生物学鉴定发现分离获得病原菌与接种病原菌一致,表明F.oxysporum和F.solani为枇杷根腐病致病菌;进一步测定代表菌株生物学特性发现,F.oxysporum菌丝最适生长温度为25～30℃,F.solani最适生长温度为30℃;两者在p H为5～10范围内均能生长;F.oxysporum生长的最适碳源为淀粉,最适氮源为硝酸钾,F.solani生长的最适碳源为葡萄糖,氮源为酵母膏。2.利用PEG介导法建立枇杷根腐病原菌原生质体遗传转化体系,成功将GFP导入尖镰孢菌Root1和腐皮镰孢菌Root2菌株中。通过测定转化子的荧光强度、潮霉素抗性,并对转化子中插入的hph和gfp基因进行PCR验证,比较野生型菌株和转化子的菌落形态、生长速率和致病性差异,筛选出荧光强度较高,性状稳定,生长速率、致病性和菌落形态与野生型菌株一致的F.oxysporum和F.solani转化子用于后续侵染过程实时观察试验。3.利用荧光显微镜跟踪观察GFP标记菌株在枇杷植株内的侵染途径,观察发现侵染1～2天后（days post-inoculation,dpi）,分生孢子萌发后从植株的根系侵入,沿着根中柱细胞间隙进行扩展生长;3～4 dpi时,菌丝体已到达植株的根系及茎基部维管束组织,F.oxysporum侵染的主要部位在茎木质部,侵染规律是菌丝由木质部向内外扩张,从而蔓延至整个茎,而F.solani在茎中主要侵染两个部位,茎表皮和木质部;5～7 dpi时,植株茎基部的菌丝量增多,叶片主叶脉中发现菌丝生长的痕迹,在叶片中的侵染规律均为沿着主叶脉向侧叶脉扩展生长,由叶脉向整个叶片扩散,最终侵染整个植株。4.根据6个基因（18S r DNA、EF1-α、β-tublin、ITS、RPB2、CAL）分别对F.oxysporum和F.solani共设计14、15对荧光定量引物。根据F.oxysporum钙调蛋白基因（CAL）获得1对荧光定量特异性引物,引物序列为R1-F:CTTAAATCGAAAACATGAGCTAAACGC,R1-R:ACTGACCGTCCTCTA ATCGTCTTGG,其特异性扩增产物大小为148bp,引物特异性良好,较常规PCR灵敏度高100倍。以导入目的片段的重组质粒为标准品,初步探索实时荧光定量PCR反应的最佳体系,绘制了SYBR Green I实时荧光定量PCR反应的标准曲线,回归方程为Y=-1.1396x+63.912,相关系R~2为0.98,线性关系良好,将待测样品的Ct值代入回归方程中可求出拷贝数值;利用浸菌液法接种健康枇杷植株,检测其在枇杷不同组织中的定殖情况,结果显示在7 dpi枇杷根部尖镰孢菌含量大幅度增加,病原菌含量随着时间均呈现先增加后减少的趋势。5.以尖镰孢菌Root1和腐皮镰孢菌Root2侵染枇杷根部,利用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）测定侵染前、后四大类植物激素水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA）中14种激素的含量变化及其合成代谢与信号转导相关基因的表达变化,结果显示侵染后SAG、JA-ILE含量较侵染前差异极显著（p＜0.05）,JA含量存在显著差异（p＜0.1）,其余激素含量差异不显著;枇杷镰孢根腐菌侵染后SAG呈上调趋势,而JA-ILE和JA呈下调趋势,q PCR结果表明,上述激素的合成代谢与信号转导相关基因表达变化趋势与激素含量变化趋势基本一致,且抗病相关基因的表达也与其密切相关。可见,镰孢菌的侵染主要诱导SA信号途径的系统防御反应,抑制JA信号途径的防御反应,推测镰孢菌诱导增强枇杷抗性的机制可能以SA介导的系统获得性抗性（Systemic acquired resistance,SAR）途径为主。