核酸适配体作为一类能够识别特定靶标的人工单链寡核苷酸,具有特异性高、无免疫原性、性质稳定、易修饰和成本低等特点,被广泛应用于生物传感和疾病诊断治疗领域。然而,目前围绕适配体的分析应用大多停留于方法学研究阶段,尤其是体内应用还远远没有抗体普及,可选的靶标也十分有限。究其原因,主要是适配体和靶标间的相互作用机制不明确、形成的复合物高级结构不清晰及缺乏有效的表征手段等。与蛋白质结合的适配体因其碱基序列的不同,可通过形成发卡、G-四链体等二级结构与靶蛋白形成高亲和力和特异性的结合。由于适配体结构的多样性,易受所处的微环境（阳离子、pH、小分子结合等）影响,因此阐明影响适配体结构及稳定性的各种因素,构建快速高效的分析方法精确解析靶蛋白与适配体间的作用机制,将对适配体的筛选与分析应用起到积极的推动作用。基于以上研究思路,本课题的具体研究内容如下:1、选取人α-凝血酶的适配体（TBA）为研究对象。TBA是一条15 mer的富含鸟嘌呤（G）序列,形成的G-四链体结构及稳定性直接影响其与凝血酶的亲和力和特异性。这里发展一套简便有效的策略,通过引入小分子与TBA结合来诱导其G-四链体结构的形成并提高其稳定性,有望促进TBA对靶标凝血酶识别能力的提高。通过电喷雾质谱（ESI-MS）法筛选能够与TBA结合的天然产物分子（药根碱L1等）。结合圆二色谱（CD）、紫外（UV）和荧光光谱法确定L1结合能够显著提高TBA的解链温度,结合常数达到105数量级,表明结合能够促进TBAG-四链体结构的形成与稳定。同时,通过ESI-MS谱图检测到TBA与L1结合的复合物由1:1缓慢转变为1:2的动态变化过程。2、为了研究细胞色素c（Cyt c）和核酸适配体（Apt40）间的相互作用,利用毛细管电泳质谱联用（CE-MS）技术构建了一种在线的氢氘交换质谱（CE-HDX-MS）方法。CE作为微量反应器,实现在线的氢氘交换反应,并通过压力辅助技术调控氢氘交换时间和交换度。利用一种改进后的“自上而下”质谱（Top-down MS）法,有效提高了多肽碎片信息的序列覆盖率和空间分辨率。通过比较氘代前后的多肽碎片信息,得到了 Cyt c的二级结构和溶剂可及性的分布情况,结果与已有的核磁共振（NMR）数据基本一致。同时,利用非变性质谱（Native MS）得到了 Cyt c与Apt40结合的复合物离子。总之,通过对该CE-HDX-MS方法的构建以及条件的优化,从多个方面验证了该方法的可行性,为深入解析Cyt c与Apt40的相互作用机制以及Apt40结合对Cyt c空间结构的影响打下基础。