论文部分内容阅读
目的:T型钙通道,也称为低电压激活钙通道,是电压依赖型钙离子通道家族中的成员,有三种亚型:Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3,广泛分布于中枢及外周神经系统,其中就包括脊髓背角II层,即胶状质(Substantia gelatinosa,SG)区。SG区是伤害性刺激向中枢传递的初级门户,主要由兴奋性和抑制性中间神经元组成,与疼痛信息的传递与整合密切相关。为了进一步探讨T型钙通道在痛信息传递中的作用,本实验研究了3-5周龄幼年SD(Sprague-Dawley)大鼠脊髓背角SG区表达T型钙电流的神经元的形态及电生理特性,以期为揭示T型钙通道在疼痛传导通路中的作用及机制提供理论基础。方法:首先,选取幼年雄性SD大鼠,制作450μm的脊髓腰骶膨大部位(L1-S3)横切片,使用全细胞膜片钳技术记录SG神经元的电生理特性:包括主动膜特性、被动膜特性以及T型钙电流;并运用T型钙通道阻断剂氯化镍、TTA-A2等药物,研究这些药物对T型钙电流阻断的药理学特点,如药物的起效时间、作用高峰时间、可逆性、剂量依赖曲线及半抑制有效浓度(IC50)等。其次,选取同上SD大鼠,制备300μm的脊髓纵切片,在电极内液中加入荧光染料Neurobiotin 488(0.05%)标记所记录的神经元,全细胞封接后至少持续20分钟以上。在完成电生理记录后,将含有神经元的脊髓切片固定在多聚甲醛(PFA)中,然后经脱水、染色、封片、激光共聚焦拍片等步骤,记录SG神经元形态学特性,分别对表达和不表达T型钙电流的神经元形态学特点进行统计学分析。结果:通过脊髓横切片的电生理数据统计可得,44.5%(178/400)的SG神经元表达T型钙电流且该电流可被氯化镍和TTA-A2完全阻断,电生理特点主要有以下几方面:1、T型钙电流的幅值取决于超极化预刺激的强度和持续时间;2、T型钙电流产生和达到峰值所需的电压分别为-70 mV和-35 mV;3、与不表达T型钙电流的SG神经元相比,表达T型钙电流的SG神经元具有更负的动作电位阈值。而TTA-P2作为一种特异性的T型钙通道阻断剂,不仅可以升高SG神经元的动作电位阈值,还可增大动作电位阈值和静息膜电位之间的差值。在SG神经元中记录到7种放电模式,分别为Tonic-firing,Delayed-firing,Single-firing,Initial-burst,Phasic-bursting,Gap-firing以及Reluctant-firing。我们发现大多数表达T型钙电流的神经元是Tonic放电的神经元(76.5%)。除此之外,SG神经元按形态分可为五大类:islet(岛神经元),central(中央神经元),radial(放射状神经元),vertical(垂直神经元)以及unclassified(未分类神经元)。形态学分析结果发现,表达T型钙电流的SG神经元以islet神经元为主(41.2%)。结论:综上所述,本研究揭示了T型钙通道在大鼠脊髓背角SG神经元上的特异性分布及其对SG神经元功能的调控作用,这些结果可为T型钙通道在痛觉传递过程中所扮演的角色和进一步分析其功能提供新的思路。