研究背景：冠心病是导致人类死亡的主要病因之一,因为心肌缺血损伤和缺血再灌注损伤导致患者死亡或心力衰竭发生率非常高。对于急性心肌梗死患者,利用溶栓或早期用经皮冠状动脉介入治疗进行有效的心肌再灌注是缩小心肌梗死面积,改善临床转归的有效方法。但是对于心肌缺血后损伤和缺血再灌注损伤对心功能的影响和突发心脏事件的发生如何预测和减低是非常棘手的问题。尽管我们对心肌缺血再灌注损伤的机制目前研究发现主要认为是中性粒细胞聚集、钙超载或钙再分布、线粒体能量合成障碍、氧自由基生成、细胞因子、心肌细胞凋亡等现象所引起的,但是我们是否能对引起这些变化的相关调控物质予以检测和干预来达到理想的效果呢?缺血是由于供血障碍引起的组织供血不足的病理表现,组织缺血导致的疾病称缺血性疾病,是可以发生在多种组织器官上的常见疾病。再灌注是指组织缺血后恢复供血的过程,缺血再灌注实际上包括缺血和再灌注两个方面,缺血是引起疾病的原因,,也是再灌注的条件。及时的心肌再灌注治疗,如溶栓、经皮冠状动脉介入治疗(PCD等都可以重建冠状动脉血运,使缺血心肌得到再灌注,从而减少心肌坏死面积,是急性心肌梗死(AMI)治疗的关键。但近来研究发现,冠状动脉的骤然开通与血流恢复,会引起血管内皮细胞功能异常、激活相关炎症因子等,反而会加重缺血心肌的损伤,导致再灌注损伤。AMI的动物研究结果已经表明,40%-50%的坏死心肌为再灌注损伤所引起,这种损伤的存在减弱了积极再灌注治疗所得到的益处。因此,减少再灌注损伤成为AMI防治的非常重要环节之一。心肌缺血后损伤和缺血再灌注损伤目前主要有以下几种观点：1、自由基损伤学说。当机体损伤产生的自由基超过机体的清除能力时,将对机体产生损伤作用。研究证实缺血再灌注过程中,缺血区有大量的自由基产生,如清除氧自由基能力降低或活性氧自由基(ROI)产生过多,都会导致ROI蓄积,从而引发心肌氧化应激。氧化应激是缺血组织再灌注的特征之一。而且研究证实应用自由基清除剂辅酶Q10可以减轻缺血再灌区细胞的损伤。2、钙超载是造成心肌细胞损伤的重要机制之一,缺血缺氧时心肌细胞内酸中毒,细胞内H+增加,恢复再灌注时细胞内外形成pH梯度差,刺激Na+-H+交换,使Na+大量内流。再灌注后由于能量供应和pH值的恢复,促进Na+-Ca2+交换,,细胞外的Ca2+大量内流,,造成Ca2+超载。从而使细胞膜和细胞器膜受损、促进氧自由基生成而导致心肌损伤。同时由于缺血时血管平滑肌有明显Ca2+内流增加,可致血管收缩痉挛,血管阻力增加对缺血区循环不利,使心肌梗死灶扩大。研究发现,细胞内钙离子浓度的改变是造成再灌注损伤的重要原因之一,钙超载还是多种原因导致的细胞损伤和死亡的共同通路。3、心肌能量代谢障碍。三磷酸腺苷(ATP)是细胞代谢的主要能量来源,细胞所处的生命状态和一切生命活动最终都依赖AT P的水平。如果轻度缺氧或短暂严重缺氧后复氧,细胞仍可生成部分ATP,可为凋亡所需能量提供保障,促使细胞发生凋亡。反之,如果较长时间严重缺氧,细胞由于AT P骤减导致凋亡所需能量不足而发生坏死；当ATP生成被完全抑制后细胞发生坏死,提示ATP在缺氧诱导细胞死亡过程中是细胞死亡方式的决定性因素之一。能量代谢障碍也是自由基产生的基础,自由基损伤又可加重能量代谢障碍,两者也是互为因果的关系。所以说,线粒体损伤和能量代谢障碍是心肌缺血再灌注损伤的重要原因,细胞内的AT P水平是决定细胞发生凋亡或坏死的主要因素。4、内皮细胞抗氧化系统损伤,研究证明内皮细胞的抗氧化活性与其对氧化活性的敏感性之间有一定的关系。心肌缺血再灌注时,内皮细胞不仅产生大量的活性氧,而且其抗氧化活性大大降低,并对外源性的活性氧产生系统有较高的敏感性,从而引起大量活性氧的产生,远远超过了内皮细胞的防御系统,最终引起心肌的损伤。有研究表明,缺血再灌注发生的内皮细胞功能障碍及NO合成的减少,内皮素(ET)心肌缺血时ET释放增加,再灌注时ET释放进一步增加,引起了强烈的血管收缩,可直接引起心肌缺血,加重血管功能障碍,使细胞发生不可逆的损伤。组织缺氧及肾上腺素分泌增加均可导致ET的mRNA表达及ET释放,心肌缺血再灌注还可引起心肌细胞膜ET受体上调,并使冠状血管对ET的敏感性增加,冠脉小分支因而易于痉挛,可导致心肌的无复流现象。内皮细胞与中性粒细胞粘附缺血、再灌注引起中性粒细胞与内皮细胞的粘附增加,中性粒细胞与血管内皮接触时即被激活,释放OFR等毒性产物及破坏性蛋白酶,改变血管的通透性。同时活性氧产生的增加,损伤了内皮细胞和其他细胞,其作用于内皮细胞或粒细胞表面的粘附分子,促进内皮细胞的粘附,而缺氧本身也损伤内皮功能,改变其粘附性,最终导致内皮细胞破损、水肿和功能障碍,毛细血管腔被阻塞,导致虽有大血管的再灌注但局部缺血区仍无复流的现象。5、相关细胞因子作用。由于缺氧复氧的刺激,冠状血管受损,这时肿胀的内皮细胞阻碍了气体交换,而内皮细胞和平滑肌细胞的损伤使血管不能很好扩张,血管腔内中性粒细胞和血小板的聚集通过嵌顿、堵塞毛细血管,使冠脉血流更趋减少；继而血管内皮和中性粒细胞产生细胞因子、粘附因子,使中性粒细胞向血管内皮细胞粘附,并释放颗粒状弹性硬蛋白、活性氧、溶酶体酶、细胞因子和其他炎性介质。这些物质会损伤内皮、血管平滑肌细胞和心肌细胞。6、细胞凋亡参与了这一过程,细胞凋亡是缺血再灌注组织损伤功能丧失的重要原因,它是一个很复杂的过程。细胞凋亡的诱导因素很多,而在心肌缺血再灌注引起的细胞凋亡中主要机制则为自由基增多和细胞内Ca2+水平升高。由于缺血缺氧可使内源性抗氧化剂如SOD失活或耗尽,从而使AT P代谢产物在缺血缺氧心肌组织中堆积,产生大量氧自由基。氧自由基性质极不稳定,一旦形成迅速使肌膜的葡萄糖与脂质过氧化,蛋白质变性,酶失活,并使细胞内的DNA链断裂,从而诱导细胞凋亡。目前对于微小RNA在心血管系统的作用研究处于热点中。微小RNA(microRNA, miRNA)是近年发现的小的、内源性的单链的非编码RNA,大约由22个核苷酸组成,与基因表达的控制有关。它被认为是基因表达的负面调节器,通过与其目标mRNA分子的3’端非编码区互补匹配导致该mRNA分子的翻译受到抑制。目前大约有三分之一的基因受miRNA调控。最近的研究表明一些miRNA在心血管高度表达,它们在调控心血管的发育和疾病方面具有重要意义,这给心血管疾病的治疗带来了希望。研究发现大鼠离体和活体的心肌缺血/再灌注模型中miR-320的表达式持续性失调。鉴定热休克蛋白20(一种已知的心肌保护蛋白)是miR-320的靶体。敲除内源性miR-320发现通过热休克蛋白20来保护有心肌缺血再灌注诱导的心肌细胞死亡/凋亡将失去。另外的研究发现大鼠缺血6小时后心脏的缺血区miR-21的表达是明显下降的,而在周围边缘区表达是上升的。在离体转染miR-21通过其靶基因执行激活蛋白1通路来降低边缘区和缺血区细胞的凋亡。在活体中实验表明miR-1和miR-133对细胞的凋亡是起相反作用的。miR-1还通过抑制胰岛素样生长因子1的转运与细胞的死亡是联系在一起的。最近的研究发现在病人的外周循环血中也可检测出miRNAS。因此,我们可以假设外周血中miRNAs反映了组织的损害,基于此miRNAs可以作为急性心肌梗死的血清生物标记物。miR-126(microRNA-126)作为miRNAs家族中的一员,人们通过对小鼠动脉粥样硬化模型的研究,发现其在其中有调节细胞凋亡的作用。在人的内皮细胞中,对血管的形成起副调节作用,抑制细胞衍生因子1的表达。调节血管的完整性、血管内皮细胞的增值和新生血管的形成。Sun X等研究认为miR-126的下调和上调和冠心病发病无明显相关,只是和胆固醇的代谢有相关性,在高的冠心病伴低密度胆固醇(LDL)的患者中的表达量是减少的。但是Guangwen Long等在急性心肌梗死中测得血浆中的miR-126表达和急性心肌梗死有关,在急性心肌梗死中的miR-126表达是减少的,且其上调和下调与时间相关,其在不同时间的表达曲线基本是和血清肌钙蛋白Ⅰ的时间表达曲线是一致的,但彼此未见明显相关性。miR-92a作为miRNAs家族中的另一员,研究发现在人的内皮细胞中高度表达,控制新的血管生成。体内和体外的研究发现miR-92a在内皮细胞中的过度表达损害血管生成。离体的研究表明诱导缺血后组织中的miR-92a的表达明显上调。在急性心肌梗死模型中抑制miR-92a的表达回促进心脏功能的恢复。实验研究表明miR-92a不仅在内皮细胞中表达,而且在心脏成纤维细胞、心肌细胞中,拮抗niR-92a能明显降低细胞凋亡,但并没有影响细胞的生存。研究还发现miR-92a依赖性调节NO合酶来控制血管张力。研究表明在冠心病患者中的表达偏高,他汀类可以通过减低miR-92a表达来减低血脂。抑制了miR-92a可能会减少心肌梗死面积,改善心肌梗死后重塑和新生血管。在心肌缺血／再灌注中研究表明miR-92a通过促进心脏保护蛋白的合成,起到积极作用。因此,本研究从临床和基础方面对miR-92a和miR-126在心肌缺血再灌注中作用进行研究,为未来冠心病的诊治提供方法和措施。研究目的：1、通过对急性心肌梗死患者外周血中的miR-92a和miR-126表达研究,检测miR-92a和miR-126能否进一步早期诊断急性心肌梗死；2、对急性心肌梗死患者行再灌注治疗前后外周血中miR-92a和miR-126表达来阐述微小RNA在其中的可能作用。3、通过对急性心肌梗死行再灌注治疗后出现无复流现象时miR-92a和miR-126表达的研究,试图说明miR-92a和miR-126在其中的可能作用。3、通过建立小鼠的心肌缺血再灌注实验研究来推断miR-92a和miR-126在心肌缺血再灌注损伤中可能的调控机制。研究方法：1、临床外周血中微小RNA等相关标本的收集和检测1.1选择了36例证实为冠心病患者和与之年龄向匹配的3例健康者进入临床研究。分组：稳定性心绞痛组、不稳定性心绞痛组、非ST段抬高性急性心肌梗死组、ST段抬高性急性心肌梗死组、健康对照组。所有冠心病患者均行PCI治疗,AMI患者行急诊PCI治疗。1.2取冠心病患者PCI术前和PCI术后1、5天的静脉血。健康对照组为匹配的时间。将采集好的全血转移至单独的冻存管,短期保存,放入-70℃冰箱,长期保存,放入液氮中。1.3采用实时定量荧光PCR (qRT-PCR)来测定miR-92a、miR-126的表达,所有检测过程按照上海康成公司提供的试剂盒说明来进行。同时检测患者血中的相关指标：清肌钙蛋白I (cTNI)、N-端脑钠肽前体(NT-proBNP)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、D-D二聚体(D-D)等指标。并分析PCI手术时患者是否有无复流现象。1.4统计学分析：采用SPSS18.0统计软件。使用t检验或方差分析,参数以x±S表示。相关分析采用Pearson或Spearman相关分析法,P<0.05为差异有统计学意义2、动物实验中外周血中微小RNA等相关标本的收集和检测2.1小鼠心肌缺血再灌注模型的建立及分组：选昆明小鼠结扎其左冠状动脉前降支,以小鼠心肌颜色变白且心电图ST段持续弓背抬高为模型成功标志。结扎30分钟后,撤除结扎线,以心肌恢复红润且ST段下降作为再灌注模型成功标志。目前此动物模型建立是成熟的。分组：假手术组(9只)、模型组(9只)、干预模型组(9只),每组中的3只用制成组织学切片。干预模型组用阿托伐他汀(2mg/kg)每天一次灌胃,其他两组给予等量的生理盐水,共7天。2.2标本采集和相关指标的完成各组小鼠分别设计为结扎冠状动脉30分钟后再灌注12h各6只,取部分血用来检测血清中相关指标,另取血400ul,将采集好的全血转移至单独的冻存管,短期保存,放入-70℃冰箱,长期保存,放入液氮中。杀死小鼠后取不同标本(缺血区、边缘区)组织经固定-脱水-石蜡包埋-切片。2.3检测相关指标用伊文氏蓝来进行染色。细胞凋亡指数用TUNEL法。全血采用实时定量荧光PCR (qRT-PCR)来测定miR-92a、miR-126的表达。CK-MB用免疫发光法,用化学法测试超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)。2.4统计学分析采用SPSS13.0统计软件。使用t检验或方差分析,参数以x±S表示。相关分析采用Pearson或Spearman相关分析法,P<0.05为差异有统计学意义结果：临床试验的结果1、qRT-PCR显示,冠心病患者的]miR-92a表达量与健康对照组是增加的,两者之间有显著性差异(P<0.05)；不同类型冠心病患者miR-92a表达量随病情程度加重而升高(P<0.05); PCI术后miR-92a表达量是降低的,PCI术前后miR-92a表达量有显著性差异(P<0.05)；同一类型冠心病患者PCI术后随时间的变化miR-92a表达量降低(P<0.05)。2、急性心肌梗死患者(包括非ST段抬高性心肌梗死和ST段抬高性急性心肌梗死)的miR-126表达量与健康对照组是降低的,两者之间有显著性差异(P<0.05)；其他类型冠心病患者miR-126表达量与健康对照组无显著性差异(P>0.05)；急性心肌梗死PCI术后miR-126表达量是增加的,PCI术前后miR-126表达量有显著性差异(P<0.05)；同一类型冠心病患者PCI术后随时间的变化miR-126表达量增加(P<0.05)。3、急性心肌梗死患者血中的血清肌钙蛋白I (cTNI)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、D-D二聚体(D-D)的水平,发现这些指标均与miR-92a表达量无统计学意义的相关关系(r=0.162, P=0.515; r=0.424, P=0.079; r=0.361, P=0.141)。N-端脑钠肽前体(NT-proBNP)与miR-92a表达量有统计学意义的相关关系(r=0.583,P=0.011)。N-端脑钠肽前体(NT-proBNP)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、D-D二聚体(D-D)的水平均与miR-126表达量有统计学意义的相关关系(r=-0.605, P=0.033; r=-0.666, P=0.008; r=-0.616, P=0.008)。血清肌钙蛋白I (cTNI)与miR-126表达量无统计学意义的相关关系(r=-0.368,P=0.133)。4、急性心肌梗死患者再灌注治疗出现无复流现象分析：(1)miR-126表达量、miR-92a表达量、hs-CRP水平、D-D水平在两组之间有显著性差异(P<0.05)。(2)miR-126表达量与hs-CRP水平、D-D水平有统计学意义的相关关系(r1=-0.666,r2=-0.616,P<0.05),miR-92a表达量与hs-CRP水平、D-D水平有统计学意义的相关关系(r1=0.638,r2=0.623,P<0.05)。动物实验的结果1、通过使用qRT-PCR法检测出的小鼠心肌缺血再灌注不同组别(假手术组、缺血再灌注组、药物干预再灌注组)中全血中的：miR-92a.miR-126相对表达量(2-△△CT),经过分析：两者在假手术组、缺血再灌注组、药物干预组的表达量有显著性差异(P<0.05)2、假手术组、缺血再灌注组、药物干预再灌注组三组中miR-92a和miR-126和血清标志物及心肌细胞凋亡指数之间的相关关系：(1)miR-92a和CK-MB、MDA的变化是一致,而与SOD的变化是相向的。(2)miR-126表达量的变化和CK-MB、MDA的变化是相反,而与SOD的变化是一致的。(3)miR-92a表达量变化心肌细胞凋亡指数的变化趋势是一致的。而miR-126表达量的变化和心肌细胞凋亡指数的变化趋势是相反的。结论：1、发现miR-92a和miR-126参与了心肌缺血再灌注的过程。可能为早期诊断和预测无复流现象及可能提前干预提供思路。2、在心肌缺血再灌注损伤中,发现miR-92a和miR-126的表达与氧自由基和心肌细胞凋亡有关联。3、他汀类药物的干预可以改变miR-92a和miR-126的表达。