基因组重排技术是建立在DNA Shuffling原理上的一种全新的育种选育技术,它将传统诱变技术和细胞融合技术相结合,是以整个基因组为重组对象的多亲本原生质体递推式融合技术。基因组重排技术在获得性状优良的重组体方面,耗时短,可缩短育种周期,提高诱变效率,远远优于传统的育种方式。丹参酮IIA(tanshinoneIIA),又名丹参醌IIA,是一种天然的抗氧化剂,具有抗菌消炎和抗肿瘤的作用,临床主要用于治疗冠心病,缺氧引起的心肌损伤,血液微循环障碍,高血脂症引起的动脉粥样硬化等。目前,该药物主要从植物中提取获得,但植物生长周期长,品质不稳定,难以满足市场的需求。植物内生真菌可以产生与宿主相同或相似的活性成分,从而为药用植物资源开辟了一条新的途径。本研究在实验室前期研究的基础上,以产丹参酮IIA内生真菌TR21经传统诱变方法得到的4株高产菌株为亲本库,利用基因组重排技术,进一步提高了菌株产丹参酮IIA的能力,并初步比较了原始菌株与诱变菌株及融合菌株之间在分子水平上的差异。研究结果如下:(1)原生质体的制备与再生通过菌龄,酶系组成,酶解温度和时间,渗透压稳定剂的选择等方面对原生质体制备与再生的条件进行了探究。实验结果表明原生质体的制备与再生的最佳条件为:培养时间为14h的菌株,1.5%溶菌酶、2%蜗牛酶和1.5%纤维素酶的混合液作为复合酶,在30℃的水浴中,酶解2h,浓度为0.8mol/L的MgS04作为原生质体的渗透压稳定剂,PDA为基础再生培养基。此条件下,能够使原生质体的制备率达到80%,再生率达到45%。(2)原生质体的灭活通过紫外和热灭活两种方法对原生质体进行灭活实验条件探究,结果表明:原生质体紫外灭活条件是在15W的紫外灯照射距离为30cm处,照射1Omin,灭活率达到100%;原生质体的热灭活条件是50℃水浴50min,灭活率达100%。(3)基因组重排技术选育高产丹参酮ⅡA菌株以传统诱变方法得到的4株高产菌株为出发菌株,制备原生质体。通过对亲本进行两种方式的灭活后,进行融合。通过响应面分析法对融合条件进行优化,在融合剂PEG4000浓度为30%,融合时间30min,添加Ca2+浓度0.02mol/L时,融合率最高。得到的融合菌株,首先通过菌落外观和直径的测量进行初筛,然后通过液体发酵,选出产量较高的融合菌株。经过三轮的递推式融合,得到的高产菌株F3-4在生长速度和产量积累方面较原始菌株均有了较大的改善。经过HPLC检测,菌株F3-4的丹参酮ⅡA产量是原始菌株的11.06倍,通过10代的传代培养,该菌株的高产性状可以稳定遗传。(4)融合菌株分子鉴定及RAPD分析通过菌株的菌落形态学特征、显微观察和分子生物学鉴定分析,鉴定F3-4属于子囊菌门、散囊菌纲、散囊菌目、发菌科、散囊菌属、茴香裸胞壳(Emericella foenniculicola)。通过RAPD分析,结果反映了融合菌株与出发菌株和原始菌株均有了明显的差异,说明通过基因组重排,改变了基因型,丰富了菌株的遗传多样性。(5)高产菌株F3-4的培养基优化通过比较菌株F3-4在三种液体培养基:PDA培养基、查氏培养基和豆芽汁培养基中的生物量和丹参酮IIA的产量积累,发现豆芽汁液体培养基既有利于菌丝体生长又有利于丹参酮IIA的积累。采用响应面分析法优化了培养基的组成成分,确定培养基最佳C源、N源和pH,结果表明:在C源为蔗糖,不加任何N源,pH为自然的条件下,产量达到最大。经过培养基的优化,产量为原来的1.6倍。