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背景和目的:神经病理性疼痛（neuropathic pain,NP）是一种具有难治性和持久性特点的病理性疾病,主要由身体感觉系统出现损伤或病变引起,可能累及周围纤维（Aβ,Aδ和C纤维）及中枢神经元,其中中枢敏化是NP发生发展中的重要机制。作为感觉信息传入及整合的初级中枢,脊髓背角中枢敏化与神经递质、受体及离子通道有关。K+依赖性 Na+-Ca2+交换体 2（K+-dependent Na+/Ca2+-exchanger 2,NCKX2）由溶质载体家族 24 成员 2（the solute carrier family 24 member 2,SLC24A2）基因编码的钠/钾-钙交换蛋白,其在转运和维持细胞内Ca2+电生理平衡过程中发挥着关键性作用。目前,SLC24A2在NP发展中的作用尚不清楚。由于NP病程长、治疗效果不佳,且长久疼痛易导致患者心情抑郁、生活质量下降,因此积极寻找NP治疗的生物靶点具有十分重要的意义。近来miRNAs在缓解和治疗神经病理性疼痛的报道日益增多。我们利用生物信息学软件预测分析,发现miR-135a-5p与SLC24A2密切相关。本研究拟通过构建Sprague-Dawley（SD）大鼠坐骨神经慢性缩窄性损伤（chronic constriction injury,CCI）所引发的神经病理性疼痛模型,以脊髓背角为切入点,通过大鼠行为学、分子生物学检测SLC24A2表达与NP的相关性;通过细胞学实验验证miR-135a-5p和SLC24A2的靶标关系;通过动物实验检测过表达或抑制miR-135a-5p表达后SLC24A2表达水平变化与大鼠疼痛行为学和炎症因子变化之间的关系。实验探索miR-135a-5p调控SLC24A2表达参与NP的调节机制,为治疗NP寻找新靶点。研究方法:1.结扎SD大鼠左后肢坐骨神经（sciatic nerve）诱发神经病理性疼痛模型。2.用行为学检测来评估CCI模型术前、术后3天、7天、14天及21天大鼠机械性痛觉以及热痛觉过敏的程度。3.用RT-qPCR和western blotting检测假手术（Sham）组和CCI组大鼠术侧脊髓背角（L4-L6）中SLC24A2及其编码蛋白NCKX2的表达。4.用免疫荧光（immunofluorescence technique,IF）染色检测 Sham 组和 CCI 组大鼠术侧脊髓背角（L4-L6）中NCKX2的表达变化情况。用免疫荧光双标染色检测术侧脊髓背角（L4-L6）中NCKX2与NeuN、Iba1、GFAP的表达定位。5.预先鞘内注射SLC24A2-siRNA,通过疼痛行为学实验评估对照（Control）组和SLC24A2-siRNA处理组大鼠热缩足阈值（paw withdrawal latency,PWL）以及大鼠机械缩足痛阈值（paw withdrawal threshold,PWT）;通过 RT-qPCR 和 western blotting技术检测各组大鼠术侧脊髓背角（L4-L6）中SLC24A2及其编码蛋白NCKX2的表达;ELISA技术检测各组大鼠术侧脊髓背角（L4-L6）中炎症因子白细胞介素-1β（interleukin-1 β,IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的表达水平。6.预先鞘内注射Lenti-SLC24A2,通过疼痛行为学实验评估Control组、Sham组和 Lenti-SLC24A2 处理组中 CCI 模型大鼠 PWL 和 PWT;RT-qPCR 和 western blotting技术检测各组大鼠术侧脊髓背角（L4-L6）中SLC24A2及其编码蛋白NCKX2的表达;ELISA技术检测各组大鼠术侧脊髓背角（L4-L6）中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平。7.利用在线数据库,生物信息学预测SLC24A2相关miRNA。8.双荧光素酶报告基因系统证实miR-135a-5p与SLC24A2的结合。9.通过western blotting检测CCI模型大鼠鞘内注射miR-135a-5p agomir和miR-135a-5p antagomir组大鼠脊髓背角（L4-L6）中NCKX2蛋白的表达。10.通过鞘内注射和行为学实验评估CCI组、CCI+miR-135a-5p antagomir组、CCI+miR-135a-5p antagomir+NCKX2 AS-ODN（反义寡脱氧核糖核苷酸）组大鼠PWL和PWT。ELISA技术检测不同处理组大鼠术侧脊髓背角（L4-L6）中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的表达水平。实验结果:1.CCI手术对大鼠生长发育没有影响,但能引起大鼠术侧后足机械性痛觉过敏和热痛觉过敏,CCI组中术后3天开始至21天SD大鼠术侧PWL和PWT显著下降。2.RT-qPCR和western blotting结果显示CCI术后3、7天大鼠术侧脊髓背角（L4-L6）中SLC24A2 mRNA及编码的NCKX2蛋白表达水平显著降低;免疫荧光标记染色技术检测出NCKX2免疫荧光强度在CCI组大鼠术后第7天脊髓背角（L4-L6）中明显降低。3.免疫荧光双标染色表明脊髓背角（L4-L6）中NCKX2与神经元的标记物NeuN共定位,而与星形胶质细胞的标记物GFAP或小胶质细胞的标记物Ibal没有共定位。4.RT-qPCR和Western blotting实验结果表明正常大鼠鞘内注射SLC24A2-siRNA后脊髓背角（L4-L6）中SLC24A2及其编码蛋白NCKX2表达水平均显著下降,大鼠PWL和PWT明显降低,ELISA法检测结果表明脊髓背角（L4-L6）中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平增高。5.RT-qPCR和Western blotting实验结果表明CCI模型大鼠鞘内注射Lenti-SLC24A2后脊髓背角（L4-L6）中SLC24A2及其编码蛋白NCKX2表达水平均显著升高,大鼠PWL和PWT明显增加,ELISA法检测结果表明脊髓背角（L4-L6）中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平降低。6.利用 TargetScan、mirDIP、miRDB、miRcode、TarBase 等在线数据库预测出与SLC24A2存在潜在结合位点的miR-135a-5p。7.双荧光素酶报告基因法验证miR-135a-5p与SLC24A2的标靶关系。利用Lipofectamine 2000共转染SLC24A2野生型3’UTR报告质粒与miR-135a-5p共转染293T细胞后,转染miR-135a-5p agomir组的细胞荧光素酶活性显著减弱;而SLC24A2突变型3’UTR的荧光酶报告质粒与miR-135a-5p共转染293T细胞后荧光素酶活性没有明显变化。8.Western blotting 实验结果表明 miR-135a-5p agomir 组脊髓背角（L4-L6）中NCKX2蛋白表达水平下调,miR-135a-5p antagomir组脊髓背角（L4-L6）中NCKX2蛋白表达上调。9.大鼠行为学实验结果表明,CCI+miR-135a-5p antagomir组大鼠术侧PWL和 PWT 增高,但 CCI+miR-135a-5p antagomir+NCKX2 AS-ODN 组大鼠术侧 PWL和PWT又被NCKX2 AS-ODN逆转下降。10.ELISA 结果表明,CCI+miR-135a-5p antagomir 组大鼠术侧脊髓背角（L4-L6）中炎症因子 IL-1β、IL-6、TNF-α 的表达降低,但 CCI+miR-135a-5p antagomir+NCKX2 AS-ODN组大鼠术侧脊髓背角（L4-L6）中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α又被NCKX2 AS-ODN所上调。结论:1.CCI诱发大鼠产生NP,术侧脊髓背角（L4-L6）中SLC24A2mRNA及其编码蛋白NCKX2表达下调,且NCKX2主要表达于神经元;2.抑制SLC24A2表达后诱导正常大鼠产生神经病理性疼痛,提高脊髓背角（L4-L6）中炎症因子的表达水平;3.过表达SLC24A2表达可逆转CCI组大鼠神经病理性疼痛,降低脊髓背角（L4-L6）中炎症因子的表达水平;4.miR-135a-5p表达的上调或下调会影响脊髓背角（L4-L6）中NCKX2表达下降或上升;5.miR-135a-5p antagomir可以缓解CCI诱导的机械性痛觉和热痛觉过敏反应及下调脊髓背角（L4-L6）中炎症因子表达,而NCKX2 AS-ODN可逆转miR-135a-5p antagomir 的作用。