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目的:研究双氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)对喉癌细胞Hep-2及舌癌细胞Cal-27增殖抑制作用的影响,初步研究DHA联合顺铂(Cisplatin,DDP)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)以及紫杉醇(Paclitaxel,PTX)对Hep-2及Cal-27细胞增殖抑制作用的影响,探究DHA是否可通过作用于Stat3通路影响化疗药物的作用,寻求肿瘤联合化疗的新策略。方法:1体外培养喉癌细胞Hep-2、舌癌细胞Cal-27,使用不同浓度的DHA(0、10μM、20μM、40μM、80μM、160μM、320μM)分别作用24h、36h、48h,使用MTT法对细胞增殖情况进行检测。2使用不同浓度的DDP(0、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml)、5-FU(0、4μg/ml、20μg/ml、100μg/ml)、PTX(0、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml)或其与10μM的DHA联合应用,分别作用于Hep-2细胞及Cal-27细胞24h、48h,使用MTT法对细胞增殖情况进行检测。3使用DDP(1μg/ml)、5-FU(20μg/ml)、PTX(10 ng/ml)或其与10μM的DHA联合应用,作用于Hep-2细胞及Cal-27细胞24h、48h后,使用Western blot法检测蛋白Stat3,p-Stat3及凋亡相关蛋白Bcl-xl的表达情况。结果:1.1不同浓度的DHA对喉癌细胞Hep-2增殖均有抑制作用,使用析因方差分析显示,其抑制作用呈时间(Ft=4.945,P=0.03<0.05)、剂量(Fc=42.715,P=0.00<0.01)依赖性。DHA作用于人喉癌细胞Hep-2在24小时、36小时、48小时使用,使用Compu Syn软件计算IC50结果为:105.972μM、61.096μM、58.179μM。1.2不同浓度的DHA处理舌癌Cal-27细胞不同时间,所得结果显示,其抑制作用呈时间(Ft=58.476,P=0.00<0.01)、剂量(Fc=450.735,P=0.00<0.01)依赖性。DHA作用于人舌癌细胞Cal-27在24小时、36小时、48小时的IC50结果分别为:103.234μM、61.729μM、52.676μM。2.1 DHA与常用化疗药物联合应用对喉癌Hep-2细胞增殖的影响。使用MTT法测细胞生存率,析因方差分析各组间的差异,使用Com Pusyn软件绘制24小时及48小时两药物的等效线。(1)DDP作用于Hep-2细胞,对Hep-2细胞的抑制呈时间(Ft=26.141,P=0.00<0.01)、剂量(Fc=95.983,P=0.00<0.01)依赖性。10μM的DHA与不同浓度的DDP联合应用作用24小时、48小时均呈协同作用。(2)体外培养Hep-2细胞,不同浓度的5-FU作用24小时、48小时,对于细胞的抑制作用呈时间(Ft=422.750,P=0.00<0.01)、剂量(Fc=39.988,P=0.00<0.01)依赖性。等效线法分析显示:在24小时、48小时,不同浓度的5-FU与10μM的DHA联合应用,均呈协同作用。(3)PTX作用于Hep-2细胞,对细胞的抑制呈时间(Ft=245.324,P=0.00<0.01)、剂量(Fc=195.628,P=0.00<0.01)依赖性。等效线法分析结果显示:两药联合作用呈协同作用。2.2 DHA与常用化疗药物联合应用对舌癌Cal-27细胞的影响。(1)DDP及DDP联合10μM的DHA对Cal-27细胞均有抑制作用。呈时间(Ft=22.395,P=0.00<0.01)、剂量(Fc=71.572,P=0.00<0.01)依赖性。10μM的DHA与不同浓度的DDP联合应用,在24小时及48小时各浓度均呈协同作用。(2)5-FU及5-FU与DHA联合组作用,对细胞增殖的抑制呈时间(Ft=1893.202,P=0.00<0.01)、剂量依赖性(Fc=1865.411,P=0.00<0.01)。药物处理24小时、48h后,5-FU各浓度与DHA均呈协同作用。(3)PTX对细胞作用呈时间(Ft=478.170,P=0.00<0.01)、剂量依赖性(Fc=547.807,P=0.00<0.01)。等效线图解法结果显示:PTX各浓度与DHA联合作用在24小时及48小时均呈协同作用。3 Western blot检测DHA与DDP、5-FU、PTX联合应用于Hep-2及Cal-27细胞后,Stat3、p-Stat3及凋亡相关蛋白Bcl-xl表达水平的变化,使用单因素方差对结果进行分析。其中各组Stat3表达均无差别(P>0.05),对于p-Stat3、Bcl-xl的表达进行分析。(1)DDP与DHA联用组与单药组相比,p-Stat3(P=0.00<0.01)、Bcl-xl(P=0.00<0.01)的表达明显减少。DHA可能通过影响Stat3通路影响增加DDP对Hep-2、Cal-27细胞的敏感性。(2)Hep-2及Cal-27细胞在给予DHA联合5-FU处理后与单药组相比,p-Stat3(P=0.00<0.01)及凋亡相关蛋白Bcl-xl(P=0.00<0.01)明显减少。可见DHA能够通过影响Stat3通路影响5-FU对两细胞的抑制作用。(3)PTX联合DHA作用于Hep-2细胞及Cal-27细胞。PTX单药组及DHA联合PTX组p-Stat3表达均升高,且联合组增高更明显。DHA与PTX联用对细胞增殖的抑制可能并非通过影响Stat3通路作用。检测其下游凋亡相关蛋白Bcl-xl表达,显示联合组Bcl-xl的表达较单药组降低。结论:1 DHA对喉癌细胞Hep-2、舌癌细胞Cal-27细胞的增殖具有抑制作用。2体外培养喉癌细胞Hep-2、舌癌Cal-27细胞,DHA能够增强DDP、5-FU、PTX的化疗敏感性。3 DHA对DDP、5-FU、PTX的增敏作用至少部分通过Stat3通路作用,而其对于PTX的增敏作用可能并非通过Stat3通路作用。