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糖尿病黄斑水肿(diacetic macular edema,DME)是糖尿病患者视力损害的最常见原因,由于生活水平提升,人口预期寿命延长,糖尿病发病率在全球范围内攀升,DME患病率随之呈上升趋势。现阶段,抗血管内皮生长因子(vascular endothelium growth factor,VEGF)药物是DME的临床一线疗法,能有效降低黄斑水肿,挽救患者视力,但由于作用靶点有限,存在药物作用时效短,需反复治疗等不足,而且临床发现约有30%DME患者对抗VEGF药物具有耐药性或无应答,视力受到极大威胁,严重影响患者生活质量,为社会带来巨大医疗负担。中医具有“整体观念和辨证论治”的诊疗优势。课题组前期研究发现,消肿颗粒联合康柏西普治疗方案有利于DME患者眼局部及全身症状的改善,但其疗效机制仍缺乏现代医学研究。如今,发展迅速的视网膜成像技术不断革新眼科诊疗水平,新近开发的MAIA微视野实现了视网膜成像和视网膜敏感度重合分析,有利于精确定位视网膜功能的改变;OCTA实现了定性分析视网膜形态结构和定量检测视网膜微血管及灌注的有效结合,使无创评估DME患者眼底微循环变化成为可能。基于此,本课题结合临床试验和细胞实验,应用微视野和OCTA进一步明确消肿颗粒联合方案治疗DME的临床疗效,观察中药对黄斑视功能及血管改变的作用,并通过分子生物学技术探讨消肿颗粒保护视网膜微血管屏障功能的作用机制。目的:1.通过临床试验,明确消肿颗粒联合康柏西普治疗DME的临床疗效,并评价其安全性。2.应用MAIA微视野和OCTA,观察消肿颗粒对DME患者视功能及黄斑区血管改变的影响。3.通过细胞实验,观察消肿颗粒对高糖下人视网膜血管内皮细胞(human retinal vascular endothelial cell,HRMEC)功能和结构的影响,初步探讨中药保护血-视网膜内屏障(inner blood-retinal barrier,iBRB)的作用。4.观察消肿颗粒对ERK/p38MAPK信号通路蛋白及NF-κB因子的调控作用,进一步探究中药保护iBRB屏障功能和结构的分子机制。方法:1.临床试验:采用随机对照双盲试验,选取2020年9月至2021年11月中国中医科学院眼科医院消渴目病科中明确诊断为脾肾阳虚兼瘀阻目络型DME患者74例(74眼)为研究对象,依纳入研究的先后顺序按照1:1比例随机分为试验组和对照组。试验组予玻璃体腔注射康柏西普1次并联合消肿颗粒口服3个月,对照组予玻璃体腔注射康柏西普1次并联合安慰剂口服3个月。两组患者均在治疗前及治疗期间每月采集最佳矫正视力(best corrected visual acuity,BCVA)、中心视网膜厚度(central retinal thickness,CRT)、微视野参数、OCTA参数、中医证候量表评分。其中,BCVA和CRT较基线变化为治疗有效性主要评价指标;微视野参数为视功能观察指标;OCTA参数为黄斑区血流密度观察指标;中医证候量表评分为中医证候疗效指标。治疗前、后检测糖化血红蛋白(HbAlc)和肝肾功为安全性评价指标。微视野参数:包括平均视网膜敏感度阈值(Average threshold,AT)、半径1°注视率(P1)、2°注视率(P2);由注视点组成的63%二元轮廓椭圆面积(BCEA63)及95%二元轮廓椭圆面积(BCEA95)。OCTA参数:包括血管密度(VD)、FAZ面积、FAZ周长(PERIM)、非圆指数(AI)、FAZ区域300μm宽度内血管密度(FD-300)。2.细胞实验:(1)选取人视网膜血管内皮细胞(HRMEC)为研究对象,并制备空白大鼠血清以及消肿颗粒低、中、高剂量含药血清。将实验细胞分为6组:正常组(HRMEC+5mmo/L低糖)、模型组(HRMEC+25mmo/L高糖)、空白血清对照组(HRMEC+25mmo/L高糖+空白大鼠血清)、消肿颗粒低剂量组(HRMEC+25mmo/L高糖+低剂量含药血清)、消肿颗粒中剂量组(HRMEC+25mmo/L高糖+中剂量含药血清)、消肿颗粒高剂量组(HRMEC+25mmo/L高糖+高剂量含药血清)。采用Transwell法检测各组实验细胞通透性变化;采用免疫荧光法检测各组实验细胞紧密连接蛋白ZO-1和细胞骨架F-actin表达分布情况。(2)采用western blot法检测各组实验细胞中NF-κB因子及ERK、p38 MAPK磷酸化蛋白表达水平。结果:1.临床试验:(1)两组患者视力及CRT比较:两组患者治疗后BCVA字母数较基线明显提高。试验组和对照组患者治疗1个月后视力改善最为明显,分别提高9.58±0.54和7.09±0.70个字母数,试验组提高字母数显著高于对照组(P<0.05);治疗2个月后视力分别提高6.14±0.62和4.67±1.01个字母数,组间无明显差异(P>0.05);治疗3个月后视力分别提高6.83±0.52和2.48±0.52个字母数,试验组提高字母数显著高于对照组(P<0.05)。两组患者治疗后CRT较基线明显下降。试验组和对照组患者治疗1个月后CRT下降最明显,分别为-130.89±17.35和-102.82±16.22μm,组间无明显差异(P>0.05);治疗2个月后CRT变化分别为-75.58±14.29和-45.79±13.02μm,组间无明显差异(P>0.05);治疗3个月后CRT变化分别为-54.56±13.47和-6.82±8.70μm,试验组CRT下降数值与对照组显著差异(P<0.05)。(2)两组患者黄斑视功能比较:两组患者治疗后视网膜敏感度和固视稳定性均有不同程度提高,但组间无明显差异(P>0.05)。试验组和对照组治疗1个月后AT较基线提高最显著(t=4.598,P=0.000;Z=-3.426,P=0.001),治疗2个月和3个月后,试验组AT较基线提高值仍较稳定(t=2.907,P=0.006;t=2.532,P=0.016),对照组 AT 明显降低(t=1.741,P=0.091;Z=-0.384,P=0.701)。试验组治疗后P1和P2与基线比较均提高(P<0.05),BCEA65、BCEA95均降低(P<0.05);对照组治疗后P1、P2轻度提高,其中治疗1月后较基线差异明显(P<0.05),BCEA63、BCEA95轻度降低,但变化均无统计学意义(P>0.05)。(3)两组患者血管密度比较:试验组治疗后血管密度明显增加。与基线时比较,试验组治疗后SCP和DCP血管密度均增加(P<0.05),治疗1个月时DCP血管密度最高(t=2.763,P=0.009),治疗2个月时SCP血管密度最高(t=3.915,P=0.000);对照组治疗1个月时DCP血管密度最高(Z=-2.252,P=0.024),SCP血管密度治疗后均无明显差异(P>0.05)。治疗2个月和3个月时,试验组SCP血管密度变化显著优于对照组(P<0.05);治疗1个月和3个月时,试验组DCP血管密度变化显著优于对照组(P<0.05)。(4)两组患者FAZ相关参数比较:试验组治疗后FAZ面积、PERIM、AI降低,FD-300无明显变化;对照组治疗后各参数均无明显变化。试验组治疗3个月后FAZ面积最小(0.25±0.13mm2),与对照组比较差异显著(t=-2.928,P=0.005)。试验组治疗3个月后PERIM最小(2.01±0.79μm),与对照组比较无显著差异(P>0.05)。试验组治疗2个月后AI最小(1.15±0.13),与对照组比较差异显著(Z=-2.165,P=0.03)。试验组FD-300在治疗后轻度增加,但与基线比较无明显差异(P>0.05),与对照组比较差异显著(Z=-2.084,P=0.037)。(5)黄斑区血流密度与BCVA相关性分析:DCP血管密度、PERIM、AI与BCVA存在相关性。将治疗3个月后DME患者BCVA(log MAR)与黄斑血流密度参数进行相关性分析。相关性结果显示,BCVA(log MAR)与DCP血管密度存在负相关性(r=-0.287,P=0.017)、与PERIM、AI存在正相关性(r=0.246,P=0.041;r=0.271,P=0.024);BCVA(log MAR)与 SCP 血管密度、FAZ 面积、FD-300无明显相关性(P>0.05)。(6)黄斑视功能与BCVA相关性分析:AT、BCEA65、BCEA95与BCVA存在相关性。将治疗3个月后DME患者BCVA(log MAR)与黄斑视功能参数进行相关性分析。相关性结果显示,BCVA(log MAR)与AT存在负相关性(r=-0.327,P=0.006),与 BCEA65、BCEA95 存在正相关性(r=0.301,P=0.012;r=0.303,P=0.011);BCVA(log MAR)与 P1、P2 无明显相关性(P>0.05)。(7)黄斑区血管密度与视网膜敏感度分析:DCP血管密度与AT存在相关性。将治疗3个月后DME患者黄斑区血管密度与视网膜敏感度进行相关性分析。相关性结果显示,DCP血管密度与AT存在正相关性(r=0.239,P=0.048),SCP血管密度与AT无明显相关性(P>0.05)。(8)两组患者中医证候量表评分比较:试验组患者治疗后中医证候明显改善,试验组中医证候疗效显著优于对照组。试验组治疗前后中医总证候评分比较t=11.913,P=0.000;视物模糊比较t=10.013,P=0.000;视物变形比较t=5.656,P=0.000;暗影遮挡比较t=3.247,P=0.003;手足凉麻比较t=5.676,P=0.000;畏寒肢冷比较t=5.493,P=0.000;神疲乏力比较t=7.666,P=0.000;腰膝酸软比较t=6.472,P=0.000;五更泄泻比较t=2.376,P=0.023,差异均具有统计学意义(P<0.05)。对照组视物模糊和视物变形治疗前后差异显著(t=3.464,P=0.000;t=2.179,P=0.037),其他证候较治疗前无明显改善。试验组患者治疗前后视物模糊、视物变形、手足凉麻、畏寒肢冷、神疲乏力、腰膝酸软改善显著优于对照组(P<0.05)。中医证候疗效评定显示,试验组显效13例(36.11%),有效20例(55.56%),无效3例(8.33%),总有效率91.67%;对照组显效1 例(3.03%),有效 6 例(18.18%),无效 26 例(78.79%),总有效率 21.217%,两组患者证候总有效率比较差异有统计学意义(x2=35.077,P=0.000)。(9)两组患者安全性指标比较:两组患者治疗前后HbAlc和肝肾功能均在安全范围内。治疗前后HbAlc<10%,肝肾功能指标升高<1.5倍。2.细胞实验:(1)消肿颗粒对细胞通透性影响:HRMEC高糖损伤模型细胞通透性显著增加,并随着FITC-Dextran孵育时间延长呈现明显上升趋势(P<0.05)。消肿颗粒含药血清各剂量组能显著降低HRMEC高糖损伤模型细胞通透性,尤其中剂量组对HRMEC高糖损伤模型细胞通透性保护作用最好,与低、高剂量组间差异有统计学意义(P<0.05)。(2)消肿颗粒对HRMEC紧密连接ZO-1影响:消肿颗粒含药血清能上调ZO-1蛋白表达,保护高糖刺激下细胞间紧密连接结构完整。正常组HRMEC紧密连接ZO-1蛋白排列整齐地分布于细胞膜上,构成较为完整的细胞轮廓,免疫荧光表达量强。模型组HRMEC紧密连接ZO-1蛋白排列紊乱,在细胞边缘明显断裂及耗竭,免疫荧光表达量显著降低,与正常组比较差异显著(P<0.05)。消肿颗粒含药血清各剂量组较模型组ZO-1蛋白线性结构完整,荧光表达量显著增强,其中低剂量组和中剂量组对ZO-1保护作用更好,二者组间无明显差异(P>0.05)。(3)消肿颗粒对HRMEC细胞骨架F-actin影响:消肿颗粒含药血清能抑制高糖刺激下骨架蛋白F-actin重构,维持细胞形态。结果显示,正常组HRMEC骨架蛋白F-actin在细胞周边分布且排列整齐,细胞形态良好。模型组F-actin纤维形态及分布明显改变,细胞质内出现不规则应力纤维,细胞形态明显收缩,细胞间隙增大甚至相邻细胞断裂。消肿颗粒含药血清各剂量组与模型组比较F-actin纤维结构稳定,细胞质内应力纤维明显减少,尤其低剂量和中剂量组内皮细胞形态较为规整,细胞间隙减小。(4)消肿颗粒对HRMEC中NF-κB因子表达调控作用:消肿颗粒含药血清能抑制高糖刺激下HREMC中NF-κB因子表达。与正常组比较,模型组HRMEC中NF-κB因子表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较,消肿颗粒各剂量组HRMEC中NF-κB因子表达水平降低(P<0.05),中剂量组NF-κB因子表达量最低,各剂量组间差异有统计学意义(P<0.05)。(5)消肿颗粒对HRMEC中ERK/p38MAPK通路蛋白表达调控作用:消肿颗粒含药血清能抑制高糖刺激下HREMC中ERK和p38MAPK磷酸化蛋白表达。与正常组比较,模型组HRMEC中p-ERK、p-p38MAPK蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。消肿颗粒中剂量组HREMC中p-ERK蛋白表达水平较模型组均显著降低(P<0.05),低剂量组和高剂量组与模型组比较无明显差异(P>0.05);消肿颗粒低剂量、中剂量组HREMC中p-p38MAPK蛋白表达水平较模型组均显著降低(P<0.05)。结论:1.消肿颗粒联合方案优于康柏西普单次注射治疗,中药有助于改善视力,提高视网膜敏感度和固视稳定性,延缓黄斑水肿复发;能够改善眼局部及全身中医证候表现,临床用药安全,治疗DME具有整体和远期疗效优势。2.消肿颗粒联合方案有助于恢复视网膜血管密度,改善黄斑中心凹无血管区结构形态,中药促进黄斑区血液循环可能是治疗DME的作用机制。3.DME 患者治疗后 DCP 血管密度、PERIM、AI、AT、BCEA65、BCEA95与BCVA存在相关性,对视力预后有一定提示意义。DME患者治疗后DCP血管密度与AT存在相关性,对视功能改变有一定提示意义。4.消肿颗粒能够上调HRMEC高糖损伤模型细胞间紧密连接蛋白ZO-1,抑制细胞骨架F-actin重构,降低内皮细胞通透性,有助于保护iBRB屏障功能和结构,可能是中药改善DME患者视力,延缓黄斑水肿复发,提高视功能的作用靶点。5.消肿颗粒能够抑制ERK/p38MAPK信号通路激活,下调NF-κB因子表达,可能是保护iBRB屏障功能和结构的分子机制。