黑色素瘤是严重威胁人类健康和生命的恶性肿瘤，具有多种免疫逃逸机制，顽固性强，复发率高。目前，黑色素瘤的治疗主要是以外科手术治疗、放疗和化疗为主。大部分患者在确诊时已发生癌转移而无法实行根治切除，而手术后的放、化疗一方面能杀死肿瘤细胞，另一方面却对机体的免疫功能造成极大的损害，对提高肿瘤患者的生存率十分有限。肿瘤疫苗主要通过纠正肿瘤患者的免疫缺陷，启动机体自身特异性抗肿瘤免疫反．应，故已经成为黑色素瘤综合治疗主要手段之一。 本研究利用独特的“锚定”生物技术，对小鼠黑色素瘤细胞B16进行修饰，将GM-CSF迅速、稳定地固定在细胞表面。这种GM-CSF膜修饰B16肿瘤细胞疫苗通过增强肿瘤细胞的免疫原性，直接激活免疫活性细胞，改善肿瘤局部微环境，可诱发机体的主动抗肿瘤免疫反应(包括CD8介导的细胞毒反应)，具有治疗相应肿瘤并抑制和预防其转移和复发的疗效，无明显的毒副作用。本研究包括三部分：第一部分GM-CSF膜修饰B16细胞疫苗的制备 目的：主要对GM-CSF是否有效固定在B16细胞表面以及GM-CSF与B16细胞之间的修饰比例进行初步探索，优化GM-CSF膜修饰B16细胞的制备参数，为膜修饰肿瘤细胞疫苗的应用提供技术基础。 方法：首先用一定浓度的细胞膜修饰剂(A液)处理不同量小鼠黑色素瘤细胞(B16)，将特定亲和基团固定在细胞膜表面。含特异锚定配基的绿色荧光蛋白(GFP)与A液修饰后的B16细胞结合，确定最佳A液膜修饰B16细胞量。再用不同浓度的锚定GM-CSF液(B液)与A液膜修饰后的B16细胞混合，通过A液的桥联(锚定GM-CSF上所带的配基与固定在细胞膜表面的特定基团相结合)将GM-CSF直接固定在B16细胞膜表面。FITC标记的GM-CSF抗体与B液修饰后的细胞作用，流式细胞仪确定最佳B液修饰浓度。 结论：10<7>个B16细胞经2ml稀释后的细胞膜修饰剂(A液)修饰后，再经2m10.005mg/mL锚定GM-CSF液(B液)作用，GM-CSF在B16细胞表面达到最佳固定。经A、B液修饰后的B16细胞重悬于2ml生理盐水溶液，置于IOGy γ射线灭活，即可制成GM-CSF膜修饰的B16肿瘤疫苗，用于小鼠黑色素瘤B16的预防和治疗。第二部分GM-CSF膜修饰B16细胞疫苗的预防性免疫保护作用 目的：研究GM-CSF膜修饰后的B16细胞疫苗接种小鼠后，能否激发体内特异 性抗肿瘤免疫反应，保护小鼠免受黑色素瘤细胞的攻击。 方法：BLAB/C小鼠先接种GM-CSF膜修饰B16细胞疫苗，再接种B16细胞，建立预防组动物实验模型(Dayl，Day7接种瘤苗，Dayl4进行B16细胞攻击)。MTT、检测脾细胞增值，LDH检测CTL活性，ELISA测定脾细胞IFN-γ分泌，同时观察小鼠成瘤率，成瘤大小及存活时间。 结论：GM-CSF膜修饰B16细胞疫苗预防接种能完全保护实验小鼠免受B16细胞攻击；免疫小鼠的脾细胞CTL活性明显提高；并能有效刺激脾淋巴细胞增殖和提高IFN-γ分泌水平，与其他免疫接种组相比差异显著。 第三部分GM-CSF膜修饰B16细胞疫苗对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用 目的：对B16细胞攻击后的BALB/c小鼠进行GM-CSF膜修饰B16细胞疫苗接种治疗，观察GM-CSF膜修饰B16细胞疫苗治疗后的荷瘤小鼠脾细胞增殖、CTL活性、IFN-γ分泌情况以及肝、肺组织癌转移情况，初步分析GM-CSF膜修饰B16细胞疫苗对黑色素瘤的治疗作用。 方法：BLAB/C小鼠先接种B16细胞，再接种GM-CSF膜修饰B16细胞疫苗，建立治疗组动物实验模型(Dayl接种B16细胞，Day10，Dayl7，Day24接种瘤苗)。MTT检测脾细胞增值，LDH检测CTL活性，ELISA测定脾细胞IFN-γ分泌，HE染色观察小鼠肝、肺及接种部位肿瘤组织的病理改变，同时观察小鼠成瘤率、成瘤大小及存活时间。 结论：GM-CSF膜修饰B16细胞疫苗能抑制荷瘤小鼠肿瘤生长，提高CTL对B16肿瘤细胞的杀伤活性，延长荷瘤小鼠存活时间，完全治愈率达到25％。但在未切除肿瘤组织的情况下采取瘤苗治疗，肿瘤组织的存在会直接影响瘤苗的治疗效果，导致GM-CSF膜修饰B16细胞疫苗治疗效果不及预防作用。