背景和目的在最新发布的全球癌症报告中,根据WHO的统计,癌症是70岁前人口死亡的最大原因,肺癌占癌症相关死亡的18%;在中国癌症的统计数据中,肺癌是发病率和死亡率第一的恶性肿瘤,严重危害到了人类的健康。肺癌按照病理类型可分为两种:第一种,非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）,占到了肺癌总数的80%,是肺癌最常见的病理类型,也是目前严重危害人类生存的恶性肿瘤类型;第二种,小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）,仅占肺癌总数的20%。虽然有靶向药、免疫治疗、化疗、放疗等多种治疗手段,非小细胞肺癌患者的死亡率仍然远高于其他类型肿瘤。因此,研究非小细胞肺癌进展机制,寻找新的治疗靶点,对改善肺癌患者的预后,甚至对改善整个癌症人群的整体预后都有着重要意义。因此,关于非小细胞肺癌的深入研究迫在眉睫。代谢重编程已经成为恶性肿瘤的典型特征之一,有研究发现非小细胞肺癌存在有氧糖酵解的过程,现在已发现多种有氧糖酵解酶参与调控非小细胞肺癌的发生、发展及进展。磷酸甘油酸变位酶1（phosphoglycerate mutase 1,PGAM1）是有氧酵解过程中的关键调节酶之一,在肝细胞癌、口腔鳞状细胞癌、神经胶质瘤、尿路上皮膀胱癌、肾透明细胞癌和结肠直肠癌等多种侵袭性肿瘤中均起到了促进作用。此外,蛋白质组学分析结果表明PGAM1在非小细胞肺癌中高表达。同时,PGAM1的高表达患者存活率较低,PGAM1沉默抑制了侵袭性肿瘤表型和非小细胞肺癌细胞的mTOR依赖性糖酵解。更有趣的是,多项研究显示PGAM1抑制剂HKB99可抑制非小细胞肺癌中生长和转移并可克服其耐药性,但PGAM1在NSCLC中的作用和具体机制尚不明确,进一步深入研究PGAM1在NSCLC的调控机制可为今后NSCLC的治疗、寻找新的靶点提供更多的理论基础。MicroRNAs（miRs,miRNAs）是一种小的内源性非编码单链RNA分子,可在转录后调节基因表达。miRNA与信使RNA（mRNA）3’-非翻译区结合进行调控。miRNA调节不同的生物学过程,例如细胞增殖、分化和凋亡,miRNA表达的改变与多种常见人类疾病的发展有关,目前研究最多的就是肿瘤。miRNAs可以通过与目标靶基因的结合,从而调节蛋白质的表达,进而参与多种生物学功能。越来越多的证据表明,miRNAs作为致癌核糖核酸或肿瘤抑制剂,在大多数人类癌症的发展中起着至关重要的作用。因此我们希望能找到PGAM1在NSCLC调控过程中的上游miRNA和下游通路,以达到探讨PGAM1在肺癌中作用机制的目的。本课题旨在研究PGAM1在NSCLC中的表达水平及其生物功能,并对其促进NSCLC的发生发展机制进行初步探讨。本课题主要分为四个部分:第一部分,PGAM1在非小细胞肺癌中的表达与生存预后的分析;第二部分,PGAM1对NSCLC增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响;第三部分,miR-3614-5p/PGAM1/TGF-β信号通路对NSCLC的调控;第四部分,miR-3614-5p/PGAM1对非小细胞肺癌裸鼠移植瘤生长的影响。第一部分 PGAM1在非小细胞肺癌中的表达与生存预后的分析目的:研究PGAM1在非小细胞肺癌中的表达情况以及与非小细胞肺癌患者临床预后特征和生存预后的相关性。方法:1.利用 TCGA（https://cancergenome.nih.gov/）、GTEX（https://gtexportal.org/）、公共数据库,统计PGAM1mRNA在多种肿瘤类型中的表达情况。2.通过 TCGA 和 GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库筛选和分析非小细胞肺癌表达谱,进一步探讨PGAM1在NSCLC和正常肺组织中的表达情况及与预后的关系。3.应用qRT-PCR和Western blot方法检测PGAM1在非小细胞肺癌及正常肺组织中的表达情况。4.构建非小细胞肺癌组织芯片（Outdo cohort和ZZU cohort）,通过免疫组织化学的方法检测非小细胞肺癌中PGAM1蛋白的表达水平,并进一步分析PGAM1的表达水平和临床病理特征及预后之间的关系。5.通过qRT-PCR和Western blot方法检测分析了支气管上皮细胞16HBE和NSCLC 细胞系（A549,H460,H1299,NCI-H226 和 SK-MES-1）中 PGAM1 的表达水平,分析正常支气管上皮细胞和NSCLC细胞中PGAM1的表达差异强度。6.通过SPSS Statistics 23.0进行数据分析,Pearson进行两变量之间相关性分析,Kaplan-Meier进行生存分析,Graphpad Prism5绘图。P＜0.05有统计学意义。结果:1.公共数据库分析显示PGAM1 mRNA的表达在多种肿瘤中都显著升高。2.公共数据库分析显示非小细胞肺癌中PGAM1的表达明显高于正常组织,PGAM1 与 TNM 分期、Ki-67 和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）表达水平之间存在显著的正相关性（r=0.18,P=0.001;r=0.21,P=0.001）;且PGAM1低表达的NSCLC患者的总生存率高于PGAM1高表达组的患者（P＜0.05）。3.35例非小细胞肺癌组织中进一步验证了 PGAM1的高表达（P＜0.01）。4.Outdo cohort和ZZU cocort组织芯片分析显示,PGAM1高表达的NSCLC患者提示更晚的TNM分期（P＜0.01）且更易发生淋巴结转移（P＜0.05）。5.COX分析表明PGAM1的表达（P=0.013）和TNM分期（P=0.002）是NSCLC患者临床预后的独立预测因素。6.PGAM1 mRNA 及蛋白表达水平在 A549,H1299,NCI-H226 和 SK-MES-14种NSCLC细胞系中高于对照组16HBE细胞（P＜0.05）。小结:1.PGAM1在非小细胞肺癌中表达水平升高且与恶性临床表型相关。2.PGAM1高表达的非小细胞肺癌患者预后较差,说明PGAM1可能在非小细胞肺癌发生、发展过程中发挥了重要作用。第二部分 PGAM1对NSCLC增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响目的:构建PGAM1表达下调的非小细胞肺癌细胞株,通过体外细胞实验探讨PGAM1对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响,进一步明确PGAM1在NSCLC发展中的作用。方法:1.利用siRNA干扰技术构建PGAM1低表达的非小细胞肺癌细胞株。2.通过CCK8和EdU方法检测下调PGAM1基因表达后对NSCLC细胞增殖能力的影响。3.通过克隆形成法、Transwell方法及划痕实验检测下调PGAM1基因表达后对NSCLC细胞侵袭、迁移能力的影响。4.运用TUNEL方法和Western blot检测凋亡蛋白的方法检测下调PGAM1基因后NSCLC细胞凋亡能力的变化。5.SPSS 23进行数据分析,Student’s t检验进行两组样本间的比较,单因素方差分析进行多组样本间的比较,Graphpad Prism 5绘图,P＜0.05有统计学意义。结果:1.通过siRNA干扰技术成功构建PGAM1下调的NSCLC细胞模型。2.与阴性对照组相比,下调PGAM1基因后NSCLC细胞的增殖、迁移、侵袭下降,凋亡增加。小结:下调PGAM1的表达可降低NSCLC细胞增殖、侵袭、迁移能力,促进细胞凋亡。第三部分 miR-3614-5p/PGAM1/TGF-β信号通路对NSCLC的调控目的:初步探讨PGAM1对NSCLC生物学行为调控作用的分子机制,为进一步深入研究提供理论依据。方法:1.通过KEGG富集分析PGAM1在非小细胞肺癌进展中的相关通路。2.通过qRT-PCR和Western blot方法检测下调PGAM1对TGF-β信号通路相关分子（TGF-β、BMP4、ICAM1和VCAM1）表达水平的影响。3.基于在线预测工具（StarBase 3.0）,从TCGA数据集选择出靶向PGAM1的候选miRNAS;在NCI-H226细胞中,在候选miRNA模拟物的处理下,检测PGAM1 mRNA的表达水平,筛选到PGAM1最可能的上游调控miRNA。4.通过生物信息学预测及双荧光素酶报告基因实验和RIP实验验证miR-3614-5p与PGAM1之间的关系。5.从TCGA数据库、GEO数据集中分析NSCLC组织中miR-3614-5p的表达水平,并通过qRT-PCR检测miR-3614-5p在非小细胞肺癌和配对癌旁组织中的表达水平。6.利用qRT-PCR和Western blot技术检测在细胞株NCI-H226和SK-MES-1中过表达miR-3614-5p及下调miR-3614-5p后PGAM1 mRNA和蛋白的表达情况。7.利用功能回复实验验证miR-3614-5p/PGAM1/TGF-β调控通路。8.统计学方法:SPSS 23进行数据分析,Student’s t检验进行两组样本间的比较,单因素方差分析进行多组样本间的比较,P＜0.05有统计学意义。结果:1.KEGG富集分析发现PGAM1高表达与TGF-β信号通路密切相关。2.PGAM1沉默后TGF-β信号通路相关分子（TGF-β、BMP4、ICAM1和VCAM1）的表达水平明显下降（P＜0.05）。3.TCGA数据集分析选择出了 7个靶向PGAM1的候选miRNAS,其中miR-3614-5p的表达显著降低了 PGAM1的mRNA水平（P＜0.01）。4.生物信息学分析结果显示miR-3614-5p与PGAM1存在连续互补的核苷酸结合位点,双荧光素酶报告基因实验和RIP实验证实了 miR-3614-5p与PGAM1之间可相互作用。5.公共数据库及组织学验证均显示miR-3614-5p在NSCLC中的表达下降;miR-3614-5p与NSCLC组织中PGAM1的水平呈负相关（P＜0.01）。6.过表达 miR-3614-5p 后在细胞株 NCI-H226 和 SK-MES-1 中 PGAM1 mRNA和蛋白的表达水平较对照组明显降低（P＜0.01）。7.过表达miR-3614-5p后NSCLC的增殖、侵袭、迁移能力下降,TGF-β信号通路相关蛋白TGF-β,BMP4,ICAM1 and VCAM1蛋白表达下降（P＜0.01）;过表达PGAM1能够部分逆转miR-3614-5p对NSCLC细胞的增殖、侵袭、迁移能力的抑制作用及对TGF-β信号通路相关蛋白的抑制效应（P＜0.05）。小结:miR-3614-5p通过调控PGAM1/TGF-β信号通路,进而影响非小细胞肺癌的增殖、侵袭及迁移能力。第四部分 miR-3614-5p/PGAM1对非小细胞肺癌裸鼠移植瘤生长的影响目的:体内实验探索miR-3614-5p/PGAM1对NSCLC增殖能力的影响。方法:1.构建 PGAM1 敲减组（shPGAM1）、PGAM1 过表达组（PGAM1）、miR-36145p过表达组（lenti-miR-3614-5p）及相应的对照组NSCLC裸鼠移植瘤模型。2.利用小动物活体成像技术在体内观察不同模型组裸鼠肿瘤生长情况,记录皮下瘤体积、重量的变化并绘制生长曲线。3.5周后处死裸鼠,剥离出瘤组织进行称重,对裸鼠移植瘤组织进行HE、Ki-67、PGAM1免疫组化染色。4.瘤组织进行免疫组化染色检测TGF-β信号通路相关蛋白TGF-β,BMP4,ICAM1和VCAM1的表达水平,并对TGF-β信号通路相关蛋白TGF-β,BMP4,ICAM1和VCAM1的表达进行评分。5.统计学方法:SPSS 23进行数据分析,t检验进行两组样本间的比较,Graphpad Prism 5绘图,P＜0.05有统计学意义。结果:1.PGAM1敲减组裸鼠和对照组裸鼠组相比,敲减PGAM1后NSCLC增殖速度明显减慢,肿瘤体积和重量减少;PGAM1和Ki-67的染色强度进行评分,结果提示PGAM1敲减组PGAM1和Ki-67水平明显弱于对照异种移植肿瘤。2.PGAM1过表达组裸鼠和对照组裸鼠组相比,过表达PGAM1后NSCLC增殖速度明显加快,肿瘤体积和重量增加;PGAM1和Ki-67的染色强度进行评分,结果提示PGAM1过表达组PGAM1和Ki-67水平明显强于对照异种移植肿瘤。3.miR-3614-5p过表达组裸鼠和对照组裸鼠组相比,过表达miR-3614-5p后NSCLC增殖速度明显减慢,肿瘤体积和重量减少;PGAM1和Ki-67的染色强度进行评分,结果提示miR-3614-5p过表达组PGAM1和Ki-67水平明显弱于对照异种移植肿瘤。4.PGAM1敲减组裸鼠NSCLC移植瘤组织TGF-β信号通路相关蛋白TGF-β,BMP4,ICAM1和VCAM1的表达水平低于对照组,体内实验证实了 PGAM1敲减后NSCLC细胞中的TGF-β信号通路相关蛋白TGF-β,BMP4,ICAM1和VCAM1的表达水平降低。5.miR-3614-5p过表达组裸鼠NSCLC移植瘤组织TGF-β信号通路相关蛋白TGF-β,BMP4,ICAM1和VCAM1的表达水平低于对照组,体内实验证实了miR-3614-5p过表达NSCLC细胞中的TGF-β信号通路相关蛋白TGF-β,BMP4,ICAM1和VCAM1的表达水平降低。小结:1.调控PGAM1和miR-3614-5p的表达可影响NSCLC移植瘤的生长。2.体内实验证实了 miR-3614-5p/PGAM1可调控TGF-β信号通路。全文结论:1.PGAM1在NSCLC中高表达,与NSCLC恶性临床表型和预后密切相关,有望成为NSCLC新的生物学标志物;2.PGAM1能促进NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭,减少凋亡,对NSCLC生物学行为起重要调控作用。3.miR-3614-5p可调节PGAM1,诱导TGF-β信号通路对NSCLC生物学行为进行调控。