【摘 要】
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目的:LncPrep+96kb是一种新发现的长链非编码RNA,有两个转录本分别为2.2kb和2.8kb,表达于卵巢颗粒细胞中,但其在卵巢的功能尚不清楚。本课题将探究lncPrep+96kb 2.2kb在小鼠卵巢颗粒细胞的作用和可能的机制。方法:通过原位杂交实验,探究lncPrep+96kb在小鼠卵巢的时空表达情况。分离培养原代颗粒细胞,转染lncPrep+96kb 2.2kb过表达质粒和敲除质粒,
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目的:LncPrep+96kb是一种新发现的长链非编码RNA,有两个转录本分别为2.2kb和2.8kb,表达于卵巢颗粒细胞中,但其在卵巢的功能尚不清楚。本课题将探究lncPrep+96kb 2.2kb在小鼠卵巢颗粒细胞的作用和可能的机制。方法:通过原位杂交实验,探究lncPrep+96kb在小鼠卵巢的时空表达情况。分离培养原代颗粒细胞,转染lncPrep+96kb 2.2kb过表达质粒和敲除质粒,CCK-8检测lncPrep+96kb 2.2kb对细胞增殖的影响;收集培养基,通过放射免疫法检测雌激素分泌量的变化;实时荧光定量PCR和蛋白印迹检测芳香化酶的表达变化。通过RNA免疫共沉淀法鉴定lncPrep+96kb 2.2kb的特异性结合蛋白。通过生物信息学技术预测lncPrep+96kb 2.2kb与特异性结合蛋白EDF1的结合位点。突变结合位点,观察是否可以逆转lncPrep+96kb 2.2kb对颗粒细胞雌激素合成及芳香化酶表达的影响。结果:原位杂交实验发现lncPrep+96kb主要表达于小鼠卵巢初级卵泡和次级卵泡的颗粒细胞中,随着卵泡发育,表达减少。LncPrep+96kb 2.2 kb对颗粒细胞的增殖没有影响;过表达lncPrep+96kb 2.2kb抑制了雌激素的合成和芳香化酶的表达,敲除lncPrep+96kb后,雌激素的合成和芳香化酶的表达增加。RNA免疫共沉淀显示lncPrep+96kb 2.2kb可以特异地结合EDF1,进一步研究发现lncPrep+96kb2.2kb促进了EDF1在颗粒细胞的核质异位。干扰EDF1后雌激素的分泌和芳香化酶的表达都减少。通过信息生物学分析发现,lncPrep+96kb 2.2kb 603-690和1979-2077位点是与EDF1相互结合的主要位点,突变这两个位点后发现,lncPrep+96kb 2.2kb 1979-2077的突变逆转了lncPrep+96kb 2.2 kb对雌激素合成及芳香化酶的作用。结论:(1)LncPrep+96kb 2.2kb可抑制卵巢颗粒细胞雌激素分泌和芳香化酶的表达;(2)LncPrep+96kb 2.2kb能够特异地结合EDF1并促进其核质异位;(3)沉默EDF1可以抑制雌激素的分泌和芳香化酶的表达;(4)LncPrep+96kb 2.2kb 1979-2077位点是结合EDF1的关键位点,可介导lncPrep+96kb 2.2kb对雌激素合成的影响及调节芳香化酶的表达。
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