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本实验采用大鼠单侧输尿管结扎方式,模拟梗阻性肾病的早期病变。给以醛固酮受体阻断剂依普利酮及化瘀通络中药肾络通干预治疗,观察对醛固酮活化诱导的细胞增殖的抑制作用和机制,为梗阻性肾病的中药治疗提供理论依据及动物实验数据。 第一部分 治未病的理论探讨及在梗阻性肾病中的意义 “治未病”是中医治疗、养生的重要组成部分,包含未病先防、已病防变、已变防渐、愈后防复等方面,涉及到疾病的发生、发展、转归、预后等。 肾系疾病如水肿、淋证、癃闭、关格等是相互关联且传变的病证。肾病的预防同样需要“治未病”,主要是“已病防变”、“已变防渐”和“愈后防复”。 简述了“治未病”的广义和狭义概念,以及治未病的学术渊源。此外还介绍了梗阻性肾病的病变特点,以及治未病思想对梗阻性肾病的治疗指导意义。 梗阻性肾病早期仅是梗阻侧改变,日久健侧受损,终致两肾俱伤。健侧损伤的中医机制认为是“病及同脏”即梗阻侧肾脏日久影响健侧肾脏。根据中医“治未病”“已病防变、已变防渐”理论,结合梗阻性肾病“肾络瘀阻”的中医病机,给以益气活血、化瘀通络中药,观察对健侧肾脏的保护作用,为临床治疗提供依据,阐明“治未病”理论的指导意义。 第二部分 梗阻性肾病大鼠健侧肾脏病理形态学改变及肾络通的影响 目的:建立梗阻性肾病大鼠模型,观察大鼠一般情况,健侧肾脏病理状态以及纤维化指标的改变,以验证肾络通及盐皮质激素受体阻断剂对健侧肾脏的保护作用。 方法:48只Wistar大鼠随机分为空白组(Sham group)、模型组(UUOgroup)、依普利酮组(EPL group)、中药组(SLT group),每组12只。实验动物适应性饲养1周后,除空白组(Sham group),其余大鼠制备单侧输尿管梗阻模型。术后开始给药,西药组给以依普利酮100 mg/(kg.d)从饲料中加入,中药组给于肾络通煎剂26 g/(kg.d)入水瓶饮用。空白组及模型组给予正常饮食和水。观察一般情况,连续干预10天。于实验结束时,各组大鼠称重后断头处死,切取双侧肾脏,称重,部分肾脏4%多聚甲醛固定以备肾脏病理及免疫组化检测,其余肾脏液氮速冻后-70℃保存以提取蛋白及mRNA检测。 结果: 1.各组大鼠一般情况比较 实验中假手术组大鼠一般情况良好:每日饮食、饮水稳定,体重逐步增长,毛发有光泽,对外界刺激反应灵敏。健侧肾脏重量UUO组、依普利酮组及中药组较假手术组均有增大(P<0.05),但3组间无显著差异。 2.各组大鼠肾组织病理形态学改变 HE染色分别观察梗阻及健侧肾脏,结果显示,假手术组双侧肾脏结构基本正常,肾小管上皮细胞排列整齐,无浊肿,间质无水肿,偶见炎性细胞浸润。UUO组梗阻侧肾脏明显增大,肾小管扩张,肾小管上皮细胞浊肿、坏死、脱落,肾间质水肿,大量炎性细胞浸润;健侧肾脏部分上皮细胞浊肿,肾小管间质炎性细胞浸润增多。依普利酮组及中药组梗阻侧肾脏增大,肾小管扩张,上皮细胞浊肿或坏死,但肾间质炎性细胞浸润较UUO组明显减少;健侧肾脏肾小管上皮细胞轻度浊肿,肾间质少量炎性细胞浸润,两治疗组病理改变无明显差异。Masson染色检测纤维化改变,结果显示,假手术组双侧肾脏仅有少量纤维成分表达,可见于基底膜及肾间质;UUO组梗阻侧肾脏胶原成分明显增多,大量表达在肾间质;健侧肾脏胶原沉积有增多趋势。依普利酮组及中药组梗阻侧肾脏有大量纤维成分沉积,但较UUO组显著减少;健侧肾脏与假手术组相比有增多趋势,但较UUO组减轻。 3.各组大鼠α-SMA肾脏表达 免疫组化检测大鼠健侧肾脏α-SMA表达,结果假手术组仅见于血管平滑肌细胞,其他部分表达不明显。UUO组大鼠健侧肾脏α-SMA阳性表达明显增强,主要见于肾小管上皮细胞胞浆。与UUO组相比,依普利酮组及中药组α-SMA阳性表达明显减轻,两组之间无明显差异。 小结:梗阻性肾病实验动物健侧肾脏表现为代偿性增大,肾间质炎性细胞浸润增多,纤维化指标α-SMA明显升高,MCP-1、TNF-α等炎性因子表达增强,细胞增殖明显。 第三部分 肾络通对健侧肾脏炎性介质以及细胞增殖的抑制作用 目的:建立梗阻性肾病大鼠模型,观测健侧肾脏的炎性浸润及细胞增殖情况,以验证炎性损伤和细胞增殖是否参与到梗阻性肾病健侧肾脏的损伤过程,以及肾络通及盐皮质激素受体阻断剂对健侧肾脏保护作用的机制。 方法:动物分组、模型复制、给药方法同第二部分,共10天。采用ELISA测定血清MCP-1含量,免疫组化及Western blot检测健侧肾脏TNF-α、PCNA表达。统计学方法同第二部分。 结果: 1.各组大鼠血清MCP-1含量表达比较。 2.健侧肾脏TNF-α定位及半定量分析。 3.健侧肾脏PCNA定位及半定量分析。 小结:醛固酮活化可通过ERK磷酸化及SKG-1信号通路激活NF-κB,诱导细胞增殖,参与肾脏损伤。 第四部分 肾络通对健侧肾脏ERK/NF-κB通路的调控作用 目的:建立梗阻性肾病大鼠模型,观测健侧肾脏的炎性信号通路ERK/NF-κB的相关因子,以验证经典炎性反应通路是否参与健侧肾脏损伤,以及肾络通及依普利酮对健侧肾脏保护作用的具体机制。 方法:动物分组、模型复制、给药方法同第二部分,共10天。实验结束留取健侧肾脏标本,采用免疫组化及Western blot对P-ERK1/2、NF-κB进行定位定量分析。统计学方法同第二部分。 结果: 1.免疫组化检测P-ERK1/2表达,依普利酮及中药组阳性表达较UUO组明显减少。 2.免疫组化检测NF-κB表达,依普利酮及中药组表达减弱。 3.Western blot检测p-ERK1/2、ERK1/2表达 检测健侧肾脏p-ERK1/2、ERK1/2表达,结果显示UUO组p-ERK1/2及ERK1/2均较假手术组表达增强,依普利酮及中药组较假手术组表达增强,但较UUO组明显减弱。UUO组p-ERK1/2、ERK1/2较假手术组有显著性差异,治疗组与UUO组亦有显著性差异。 4.Western blot检测NF-κB表达 假手术组NF-κB呈弱表达,UUO组表达明显增强,与假手术组相比有显著性差异;依普利酮及中药组较UUO组表达显著减轻,统计学处理有明显差异。 小结:梗阻性肾病健侧肾脏ERK及NF-κB可因炎性损伤被激活,诱导健侧肾脏的炎性损害及细胞增殖,参与肾间质纤维化的进展。依普利酮和肾络通可下调其表达,抑制细胞增殖,保护健侧肾脏的功能和结构,延缓疾病进展。 第五部分 肾络通抑制醛固酮活化调控SGK-1表达的作用 目的:建立梗阻性肾病大鼠模型,对健侧肾脏SGK-1进行分析,以验证肾络通及盐皮质激素受体阻断剂是否通过阻断醛固酮-SGK-1途径,保护健侧肾脏。 方法:动物分组、模型复制、给药方法同第二部分,共10天。实验结束时留取肾脏标本,采用Real time-PCR、免疫组化、Western blot对健侧肾脏SGK-1含量进行定位定量分析。统计学方法同第二部分。 结果: 1.健侧肾脏SGK-1 mRAN定量分析 与假手术组相比,UUO组SGK-1表达较明显上调;依普利酮组及中药组SGK-1表达较模型组明显下调,有统计学意义(P<0.01)。 2.免疫组化检测结果 假手术组SGK-1呈弱表达,主要见于肾小管上皮细胞胞浆;UUO组表达明显增强,皮质及髓质均有高表达;依普利酮组及中药组有阳性表达,但较UUO组明显减弱。 3.Western blot检测结果 半定量分析SGK-1蛋白表达,结果显示UUO组蛋白表达较假手术组明显增强,有非常显著性差异(P<0.01);依普利酮组及中药组较UUO组表达减弱,有统计学意义(P<0.01)。 小结:醛固酮受体阻断剂依普利酮及中药肾络通对健侧肾脏的保护机制与抑制醛固酮诱导的炎性损伤有关,通过SKG-1及ERK磷酸化通路,下调NF-κB表达,抑制细胞增殖,减轻梗阻性肾病健侧肾脏的损伤,延缓纤维化进程。 结论: 1.“治未病”理论内容丰富,涉及未病先防、已病防变、已变防渐、愈后防复等。中医“治未病”理论在肾脏疾病的传变、治疗和预防应用中有重要意义。应用“已病防渐,已渐防变”学说揭示梗阻性肾病的发病机制以及对健侧肾脏的保护作用有临床应用价值。 2.梗阻性肾病实验动物健侧肾脏表现为代偿性增大,肾间质炎性细胞浸润增多,纤维化指标α-SMA明显升高,MCP-1、TNF-α等炎性因子表达增强,细胞增殖明显。 3.醛固酮活化可通过ERK磷酸化及SKG-1信号通路激活NF-κB,诱导细胞增殖,参与肾脏损伤。 4.梗阻性肾病健侧肾脏ERK及NF-κB可因炎性损伤被激活,诱导健侧肾脏的炎性损害及细胞增殖,参与肾间质纤维化的进展。依普利酮和肾络通可下调其表达,抑制细胞增殖,保护健侧肾脏的功能和结构,延缓疾病进展。 5.醛固酮受体阻断剂依普利酮及中药肾络通对健侧肾脏的保护机制与抑制醛固酮诱导的炎性损伤有关,通过SKG-1及ERK磷酸化通路,下调NF-κB表达,抑制细胞增殖,减轻梗阻性肾病健侧肾脏的损伤,延缓纤维化进程。