肺癌是世界上死亡率最高的癌症类型之一,随着临床治疗技术的优化和新型药物的应用,肺癌患者的五年生存率不断提高,但整体情况仍不容乐观。因此继续寻找安全有效的肺癌治疗药物一直是药物学家们的日标。凋亡（Apoptosis）在细胞程序性死亡中最为常见,临床应用的多数化疗药物均通过诱导细胞凋亡而抑制肿瘤细胞增殖,但凋亡抵抗的出现降低了传统化疗药的作用,因此靶向非凋亡性细胞程序死亡的药物开发吸引了研究者们的注意。副凋亡（Paraptosis）是一种新型非凋亡性细胞程序死亡方式,其以内质网和/或线粒体肿胀形成广泛的细胞质空泡为典型特征。蛋白质合成与内质网应激在副凋亡中发挥了重要作用,MAPKs的激活也与副凋亡相关。副凋亡的发生可被Alix蛋白、蛋白合成抑制剂CHX与内质网应激抑制剂4-PBA抑制。探寻副凋亡诱导剂可能为肿瘤治疗、改善肿瘤耐药提供新策略。朝藿素B（Epimedokoreanin B,EKB）是一种异戊烯基化的黄酮类化合物,由本课题组从药用植物朝鲜淫羊藿Epimedium koreanum中分离得到。EKB抑制A549与NCI-H292人非小细胞肺癌细胞增殖和迁移并诱导细胞出现明显的细胞质空泡。在EKB处理的细胞中,DAPI染色末见细胞核明显固缩和碎裂;Annexin V-FITC/PI双染色未显示明显细胞凋亡;凋亡标志蛋白PARP、Caspase-3和Caspase-9未见明显活化;Caspase抑制剂Z-VAD-FMK不能抑制细胞活力降低和细胞质空泡产生;细胞周期分析可见G0/G1期细胞比率略有增加、S期和G2/M期细胞比率略有下降,未见明显细胞周期阻滞。这提示EKB诱导细胞发生了非Caspase依赖的非凋亡性细胞死亡。内质网和线粒体染色成像显示,EKB诱导的细胞质空泡由肿胀的内质网和线粒体形成,透射电子显微镜也观察到EKB处理的细胞发生了明显内质网与线粒体肿大。此外,在EKB处理的细胞中,副凋亡分子标志物Alix表达降低,MAPK通路激活,JNK抑制剂SP600125与ERK抑制剂U0126预处理均能逆转EKB引起的细胞活力降低与细胞质空泡化,这些表明EKB诱导细胞发生了副凋亡。为探讨EKB诱导副凋亡的发生机制,我们对EKB处理的NCI-H292细胞进行了转录组测序（RNA-Seq）,结果显示EKB处理导致内质网途径相关基因发生了显著改变,推测EKB诱导的副凋亡由内质网应激及其引起的未折叠蛋白反应（Unfold Protein Response,UPR）介导。蛋白免疫印迹法检测发现,EKB诱导细胞中内质网伴侣蛋白GRP78/Bip增加,并激活IRE1α、PERK、ATF-6介导的三条UPR信号通路。此外,CHX（蛋白合成抑制剂）与4-PBA（内质网应激抑制剂）预处理能逆转EKB引起的细胞活力降低与细胞质空泡化,且CHX预处理能抑制EKB引起的UPR相关蛋白eIF2α磷酸化。这表明内质网应激在EKB诱导的副凋亡中发挥了关键介导作用。细胞内质网应激发生的同时常伴随内质网肿胀和自噬体增加。蛋白免疫印迹结果显示EKB诱导了细胞中SQSTM1和LC3-Ⅱ的表达增加。自噬双标腺病毒转染成像显示,细胞内黄色斑点数量增加,这证实EKB诱导了细胞内自噬体的形成,但自噬体与溶酶体的融合发生阻滞。内质网和线粒体肿胀可能引起其功能紊乱。内质网和线粒体是细胞内Ca2+储存的主要场所,流式细胞仪分析显示EKB显著增加了细胞内Ca2+浓度,这说明内质网和线粒体的肿胀与胞内Ca2+稳态失衡有关;ROS升高与线粒体膜电位降低是线粒体功能障碍的标志,检测结果显示,EKB引起胞内ROS升高与线粒体膜电位降低,这表明EKB在引起线粒体肿胀的同时造成了其功能障碍。上述数据证实,EKB引起了细胞内质网和线粒体的功能失衡。此外,EKB显著减弱了 A549细胞构建的斑马鱼异种移植模型中活细胞染色剂标记的A549细胞的荧光强度,表明EKB在体内对A549细胞增殖同样具有抑制作用。综上,我们证明EKB是A549与NCI-H292肺癌细胞的一种副凋亡诱导剂,这可能为肺癌的治疗、改善肿瘤化疗抵抗提供一种新的选择。在筛选安全有效的抗肿瘤药物过程中,我们对从单花山竹子Galrcinia oligantha中分离得到11个异戊烯基取代的氧杂蒽酮类化合物进行了抗A549细胞增殖抑制作用评价,发现其中一对C-12构型异构的异构体Garcioligantone J（GLJ）和Garcioligantone K（GLK）具有较好的肺癌细胞增殖抑制作用。在确定了这一对化合物构型的基础上,我们进一步开展了化合物的抗肺癌细胞增殖作用评价。细胞活力检测结果显示,GLJ和GLK具有相似强度的细胞毒作用,C-12构型未对二者的细胞毒性产生明显影响。DAPI染色结果表明GLJ和GLK处理的肺癌细胞均出现明显核固缩或碎裂;光学显微镜下观察到凋亡小体样结构;流式细胞仪显示细胞发生了凋亡;蛋白检测表明PARP、Caspase-3和Caspase-9在GLJ和GLK处理下发生激活;Z-VAD-FMK预处理可拮抗GLJ和GLK诱导的细胞活力降低和细胞形态改变。这些结果表明GLJ和GLK引起A549和NCI-H292细胞产生了凋亡。进一步检测发现,GLJ和GLK引起了细胞线粒体膜电位降低,以及Bax/Bcl-2蛋白比值增加,提示GLJ和GLK引起的细胞凋亡均为内源性凋亡。在一定条件下,持续的内质网应激可上调CHOP/GADD153从而引发细胞凋亡的产生。GLJ和GLK处理均增加了肺癌细胞中GRP78、p-eIF2α和GADD153的表达量;内质网应激抑制剂4-PBA预处理可拮抗GLJ和GLK诱导的PARP和Caspase-3活化,这些结果说明GLJ和GLK诱导肺癌细胞发生的凋亡是内质网应激介导的。内质网所处环境的氧化还原状态决定了进入其中蛋白质的命运。流式细胞仪检测发现,GLJ和GLK可升高细胞内ROS水平;ROS清除剂NAC预处理能拮抗GLJ和GLK诱导的内质网应激,同时NAC预处理可拮抗GLJ和GLK诱导的细胞活力降低、细胞形态改变、PARP和Caspase-3活化,这些结果表明GLJ和GLK诱导的内质网应激介导的细胞凋亡是ROS依赖性的。在采用A549细胞构建的斑马鱼异种移植模型中,GLJ和GLK均表现出显著的成瘤抑制作用,表明GLJ和GLK具有体内抑瘤作用。上述结果证实GLJ和GLK在A549和NCI-H292细胞中通过ROS-内质网应激-内源性凋亡途径抑制了肺癌细胞的增殖,C-12构型的差异对GLJ和GLK的抗肺癌细胞增殖影响不大,GLJ和GLK有成为抗肺癌药物的潜力。