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目的：体外构建含shRNA的硒蛋白S（Selenoprotein S，SelS）基因干扰质粒及SelS基因高表达质粒，将其瞬时转染至人脐静脉内皮细胞株（ECV304）中，将ECV304细胞分为未转染组、SelS高表达组、空载体转染组及SelS低表达组，以不同浓度的过氧化氢（H2O2）损伤后，观察各组细胞损伤前后的氧化应激指标及窖蛋白-1（Caveolin-1，Cav-1）、蛋白激酶Cα（PKCα）表达水平的差异，探讨SelS的作用是否通过PKC通路发挥作用，及此通路与Cav-1的关系，为研究内皮保护策略提供新的实验依据。
方法：
1．构建三条含shRNA的SelS基因干扰质粒及SelS基因高表达质粒，应用脂质体转染技术将质粒瞬时转染至ECV304细胞中，以GAPDH为内参照半定量检测SelS mRNA水平的表达，筛选有效干扰质粒。
2．将ECV304细胞分为未转染组、SelS高表达组、空载体转染组及SelS低表达组，以GAPDH为内参照，实时定量PCR方法检测SelS mRNA水平的表达；以β-actin为内参照，Western blot方法检测SelS蛋白水平的表达。
3．各组细胞分别经含有终浓度为0、400、600、800及1000μmol/L的H2O2的培养液作用6h后，四甲基偶氮唑蓝法（MTT）观察H2O2对细胞增殖能力的影响；取不同浓度损伤的各组细胞上清液，硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）的含量，黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶（SOD）的活力。
4．根据MTT结果，以H2O2浓度为800μmol/L的培养液作用各组细胞24h后，提取各组细胞总RNA及总蛋白，采用实时定量PCR方法检测各组细胞Cav-1及PKCα mRNA水平的表达；Western blot方法检测Cav-1及PKCα蛋白水平的表达。
结果：
1．成功构建SelS基因干扰质粒及SelS基因高表达质粒，而且设计的三条干扰质粒均可干扰内皮细胞中SelS基因的表达。实时定量PCR及Western blot证实SelS低表达组的SelS mRNA及蛋白表达水平均较未转染组、SelS高表达组及空载体转染组明显减低，未转染组与空载体转染组表达无差异（P>0．05）。
2．细胞生存率（%）；ECV304细胞暴露于含不同浓度的H2O2的培养液中6h后，细胞生存率明显下降；各浓度组的细胞生存率在SelS低表达组（84±2．0、69±1．0、60±1．5、42±1．5、23±2．0）均较未转染组、SelS高表达组及空载体转染组低（P<0．01）；在H2O2浓度为800、1000μmol/L时，SelS高表达组（71±1．5，63±2．6）的细胞生存率明显高于未转染组（64±0．5，45±2．6，P<0．01）及空载体转染组（63±1．5，42±3．5，P<0．01）；空载体转染组与未转染组相比差异不显著（P>0．05）。
3．MDA含量（nmol/ml）：各组细胞上清液中MDA的含量随着H2O2浓度的升高而增加；在H2O2浓度为600μmol/L时，SelS低表达组（6．52±0．16）的MDA水平高于SelS高表达组（3．69±0．16，P<0．05）；在H2O2浓度为800、1000μmol/L时，SelS低表达组（15．43±0．99，27．00±0．70）的MDA水平则高于未转染组（10．10±0．40，17．97±0．48，P<0．05）及空载体转染组（9．50±0．46，16．60±0．80，P<0．05）；SelS高表达组的MDA水平在这三个浓度（3．69±0．16，6．24±0．51，10．41±0．35）均低于未转染组及空载体转染组（P<0．05）；H2O2浓度为1000μmol/L时差异更为显著（P<0．01）；空载体转染组与未转染组相比差异不显著（P>0．05）。
4．SOD活力（U/ml）：各组细胞上清液中SOD的活力随着H2O2浓度的升高而减弱；在H2O2浓度为600、800、1000μmol/L时，SelS低表达组（6．62±0．53，5．09±1．65，3．48±0．88）的SOD活力则明显低于未转染组（7．52±0．29，5．70±0．22，4．62±2．33）及空载体转染组（7．12±1．63，6．10±1．78，5．00±1．27）（P<0．05，P<0．01，P<0．01），在H2O2浓度800、1000μmol/L时减低更为明显（P<0．01，P<0．01）； SelS高表达组的SOD活力（8．34±0．16、7．48±0．87、6．60±1．58）明显高于未转染组及空载体转染组，在H2O2浓度800、1000μmol/L时升高更为明显（P<0．01，P<0．01）；空载体转染组与未转染组相比无差异（P>0．05）。
5．Cav-1的表达：ECV304细胞暴露于含800μmol/L H2O2的培养液中24h后，Cav-1 mRNA表达在未转染组（1．56±0．07 vs1．14±0．04，P<0．01）、SelS高表达组（1．27±0．05 vs0．85±0．25，P<0．01）、空载体转染组（1．52±0．08 vs0．93±0．05，P<0．01）及SelS低表达组（2．84±0．07 vs0．87±0．06，P<0．01）均较损伤前明显升高；H2O2损伤后，SelS低表达组（2．84±0．07）明显高于未转染组（P<0．01）、SelS高表达组（P<0．01）及空载体转染组（P<0．01），SelS高表达组（1．27±0．05）明显低于未转染组（1．56±0．07，P<0．01）及空载体转染组（1．52±0．08，P<0．01），而未转染组与空载体转染组比较无差异（P>0．05）。H2O2损伤后与损伤前相比，Cav-1蛋白水平表达在未转染组（1．74±0．02 vs1．25±0．01，P<0．01）、SelS高表达组（1．45±0．04 vs1．23±0．02，P<0．01）、空载体转染组（1．79±0．04vs1．24±0．02，P<0．01）及SelS低表达组（2．37±0．02 vs1．26±0．15，P<0．01）均明显升高；H2O2损伤后，SelS低表达组Caveolin-1蛋白表达（2．37±0．02）明显高于未转染组（P<0．01）、SeIS高表达组（P<0．01）及空载体转染组（P<0．01），而SelS高表达组（1．45±0．04）明显低于未转染组及空载体转染组（P<0．01）；而未转染组与空载体转染组比较无差异（P>0．05）。
6． PKCα的表达：H2O2损伤后，SelS低表达组PKCα mRNA表达水平较损伤前升高（8．70±0．43 vs3．11±0．13，P<0．01）；而未转染组（2．70±0．39vs2．59±0．22）、空载体转染组（2．98±0．64 vs2．79±0．26）及SelS高表达组（2．74±0．55 vs2．62±0．25）在损伤前后则无统计学差异（P>0．05）；H2O2损伤后PKCα蛋白水平表达在SelS低表达组较损伤前升高（0．63±0．04 vs0．35±0．02，P<0．01）；而未转染组（0．35±0．02 vs0．33±0．03）、空载体转染组（0．36±0．05 vs0．35±0．03）及SelS高表达组（0．39±0．04vs0．37±0．04）在损伤前后则无统计学差异（P>0．05）。
结论：
1．高表达SelS可以明显减弱H2O2对内皮细胞生长的抑制作用，减少氧化应激时MDA的生成，增强SOD活力，对内皮细胞具有保护作用。
低表达SelS可以明显增强H2O2对内皮细胞生长的抑制作用，增加氧化应激时MDA的生成，减低SOD活力，加重内皮细胞损伤。
2．SelS保护ECV304细胞免于H2O2损伤作用可能通过PKCα通路发挥作用，并与Cav-1有关。