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目的:甲型流感病毒(IAV)可引起全球爆发和流行,导致较高的发病率和死亡率,是危害人类健康的重大公共卫生事件。气道上皮细胞是肺组织的第一道生理屏障,其对吸入性过敏原、有害颗粒和感染性病原体(如流感病毒)的防御发挥着至关重要的作用。紧密连接蛋白(如ZO-1)和粘附连接蛋白(如E-cad)作为气道上皮细胞屏障的重要组成部分,维持着气道屏障结构和功能的完整性。研究表明,在流感病毒感染过程中,肺组织中会产生大量炎症细胞因子和ROS,这些介质是气道屏障损伤的诱发因素。核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)是一种关键的抗氧化转录因子,在氧化条件下,Nrf2进入核内启动抗氧化基因(如HO-1)的转录和调控抗氧化酶,进而降低氧化损伤。Resolvin D1(RvD1)是一种来源于ω-3多不饱和脂肪酸的脂质介质,具有抗炎和抗氧化活性。研究表明,RvD1可通过抑制ROS介导的SHP2失活保护细胞间粘附连接的完整性和屏障功能。考虑IAV引起的气道屏障损伤和炎症反应与疾病进展和预后相关。RvD1作为一种有潜力的脂质介质,其对肺部感染具有重要的保护作用,但对流感病毒引起的损伤是否有保护作用,及其作用机制尚不清楚。因此,我们假设RvD1能够保护气道屏障,抑制炎症反应,旨在探讨RvD1在流感病毒引起的气道屏障损伤中的作用及机制。方法:1.分离培养原代正常人支气管上皮细胞(pNHBE);不同浓度H3N2感染pNHBE细胞,Western blot检测E-cad和ZO-1的表达,摸索最佳工作浓度;H3N2(MOI 50)感染pNHBE细胞不同时间,Western blot检测E-cad和ZO-1的表达,摸索最佳作用时间;不同浓度RvD1处理H3N2感染后的pNHBE细胞,Western blot检测E-cad和ZO-1的表达,摸索RvD1最佳工作浓度;2.分别用H3N2(MOI 50)、RvD1(200n M)、H3N2(MOI 50)+RvD1(200n M)或对照溶剂处理pNHBE细胞,采用PCR,Western blot分析及免疫荧光染色方法检测E-cad、ZO-1表达水平;3.分别用IAV(MOI 50)、RvD1(200n M)、IAV(MOI 50)+RvD1(200n M)或对照溶剂处理pNHBE细胞,采用Western blot方法分析检测Phospho-NF-κB p65,NF-κB p65,IKBα和p-IKBα水平,采用PCR方法检测IL-8和TNF-α水平;4.分别用IAV(MOI 50)、RvD1(200n M)、IAV(MOI 50)+RvD1(200n M)或对照溶剂处理pNHBE细胞,使用DCFH-DA探针检测不同处理组细胞内ROS水平;5.分别用IAV(MOI 50)、RvD1(200n M)、IAV(MOI 50)+RvD1(200n M)或对照溶剂处理pNHBE细胞,采用Western blot方法分析检测Nrf2、HO-1水平;使用核蛋白提取试剂盒提取不同处理组pNHBE细胞细胞核及细胞质蛋白,采用Western blot方法分析检测不同处理组细胞核和细胞质Nrf2水平,并分别通过与细胞核内参histone和细胞质内参β-actin比较量化;免疫荧光染色检测不同处理组Nrf2蛋白表达水平及分布;6.重组慢病毒HBLVH-Nrf2 sh RNA-PURO转染pNHBE细胞,分别用IAV(MOI 50)、RvD1(200n M)、IAV(MOI 50)+RvD1(200n M)或对照溶剂处理pNHBE细胞,采用Western blot方法分析检测ZO-1,E-cad,Nrf2,HO-1,Phospho-NF-κB p65,NF-κB p65,IKBα和p-IKBα水平;PCR检测IL-8和TNF-α水平;DCFH-DA探针检测不同处理组细胞内ROS水平;7.小鼠经气道吸入100μl 0.9%生理盐水或H3N2,并于第4、6天给予RvD1(100ng)处理,记录各组小鼠体重变化及生存情况;小鼠经生理盐水或H3N2处理7天后,收集BALF、肺组织和血清,采用ELISA方法检测BALF中IL-8及TNF-α水平,计数BALF细胞总数及瑞吉姆萨染色进一步细胞分类计数;固定肺组织,分别行HE染色及免疫组化;结果:1.H3N2(MOI 50)感染pNHBE细胞24小时,下调气道上皮细胞E-cad和ZO-1表达;RvD1(200n M)上调H3N2感染后的气道上皮细胞E-cad和ZO-1表达;2.H3N2感染pNHBE细胞后,气道上皮细胞E-cad和ZO-1的m RNA和蛋白表达水平显著低于对照组(P<0.05),RvD1处理抑制了H3N2诱导的pNHBE细胞E-cad和ZO-1的m RNA和蛋白表达下降(P<0.05);免疫荧光染色进一步证实RvD1的作用,对照组细胞膜E-cad染色明显、完整,感染H3N2后,细胞周围E-cad染色明显减弱,且不连续,RvD1处理抑制了H3N2的作用,差异有显著性(P<0.05)。3.H3N2感染pNHBE细胞显著增加胞内NFκB p65和IKBα磷酸化,提高IL-8和TNF-αm RNA水平,RvD1处理有效抑制了H3N2诱导的气道上皮细胞炎症反应水平,差异有显著性(P<0.05)。4.pNHBE细胞被H3N2感染后,细胞内的ROS水平明显升高,RvD1抑制H3N2诱导的气道上皮细胞ROS水平增加,差异有显著性(P<0.05)。5.H3N2感染下调了pNHBE细胞中Nrf2、HO-1的表达水平,而RvD1处理抑制了H3N2感染后气道上皮细胞中Nrf2、HO-1表达水平的下调,并促进Nrf2核易位。6.RvD1抑制H3N2对pNHBE细胞E-cad、ZO-1表达的下调,以及对IL-8、TNF-α水平的上调。然而当同时转染sh-Nrf2时,RvD1对H3N2诱导的pNHBE细胞E-cad、ZO-1表达下调的抑制作用减弱,同时,观察到磷酸化NFκB p65、p IKBα的表达,IL-8和TNF-α的水平及ROS的产生大量增加。7.小鼠感染H3N2 7天后,支气管和肺泡腔被炎症细胞明显浸润,BALF中中性粒细胞、淋巴细胞和细胞因子也明显增多。气道吸入H3N2后,分别于第4天和第6天给予RvD1可加速炎症的消退,RvD1处理后BALF中中性粒细胞、淋巴细胞和细胞因子明显减少(P<0.05)。而给予RvD1对病毒增殖的抑制作用不明显。RvD1缓解了H3N2感染后小鼠体重减轻,但对H3N2感染后小鼠死亡率的改变没有显著差异(P<0.05)。RvD1对H3N2诱导的气道损伤有保护作用,免疫组化结果显示,H3N2感染后小鼠支气管上皮细胞受损,E-cad染色较对照组弱,RvD1明显抑制了H3N2对小鼠气道上皮细胞的作用。此外,通过检测H3N2和/或RvD1干预后FD4渗漏,进一步观察屏障功能的变化,H3N2感染后BALF与血清FD4比值由0.743升高至1.371(P<0.05),RvD1处理后则降低至0.951(P<0.05),表明RvD1有效保护支气管上皮屏障减轻H3N2诱导的通透性改变。结论:RvD1可通过Nrf2通路减轻H3N2诱导的气道上皮屏障损伤及气道炎症反应,这可能为甲型流感病毒感染提供更好的治疗策略。