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目的:据统计,糖尿病的患病率在逐年上升,目前全世界每11个成年人中就有1个患有糖尿病,其中大约25%的糖尿病患者可以发展并发成糖尿病足患者。而我国糖尿病足的年发病率已达8.1%。糖尿病足作为糖尿病患者最严重的慢性并发症之一,其主要是足部神经、血管的病变,导致糖尿病足创面迁延不愈。既往对于糖尿病足的治疗方法如持续换药、糖尿病足创面持续的封闭负压吸引、蚂蝗等非手术治疗及清创、植皮、血管重建、神经解压等手术治疗,但疗效均欠佳。糖尿病足的治疗周期长且预后差,长期以来一直困扰着医生和患者,如何治疗重度糖尿病足避免截肢成为了一个世界难题。近年来胫骨横向骨搬移技术(Tibia Transverse Transport TTT)治疗糖尿病足在临床上取得了良好的疗效,其研究的结果显示TTT手术可以有效的诱导糖尿病足创面微血管网络的再生。但是其相关的机制尚未完全明了,本课题目的是探索TTT治疗糖尿病足促进血管再生的机制研究。方法:本研究分为三部分。第一部分:TTT治疗糖尿病足促进血管再生及微循环改善。收集临床患者术前及术后的影像学资料,及组织标本。CTA及CT灌注进行对比术前及术后患者糖尿病足的血管情况,并收集患者术前及术后1个月足部溃疡创面边缘局部组织标本进行HE染色及血管相关标记物如CD31、SMA-α等免疫组织化学的分析。第二部分:TTT激活EPCs及生长因子促进血管再生。收集临床患者术前及术后1个月的外周血。应用ELisa检测血浆中促进血管再生的生长因子及激活EPCs的因子如VEGF、PDGF-BB、TGF-β1等。同时应用流式细胞检测EPCs(促进血管生成的关键细胞)的标记物如CD34、CD133、CD309等。免疫组织化学检测局部促进血管再生的生长因子如VEGFR1、PDGF-BB、TGF-β1的局部含量等。第三部分:TTT激活Ras/Raf/MEK/ERK信号通路促进血管再生。收集患者术前及术后1个月的局部组织标本应用免疫组织化学检测通路中的关键因子Ras、Raf、MAPK6/ERK3的含量。Western-blot检测接受TTT手术后1个月及术前糖尿病足创面边缘新鲜的组织标本中Ras、Raf、MAPK6/ERK3的含量。结果:1、本实验收集20例符合条件并完成随访的患者,其中男13例(65%),女7例(35%),年龄(58±10)岁,糖尿病病程(18±8)年,糖尿病足病程(1.4±0.8)年,Texas分期(2B:0例(0%),2C:2例(10%),2D:8例(40%),3B:6例(30%),3C:2例(10%),3D:2例(10%))糖尿病足综合分型(Ⅰ型:2例(10%),Ⅱ型:9例(45%),Ⅲ型:6例(30%),Ⅳ型:3例(15%))。本次选取的20例患者均有术前、术后的组织标本、影像学资料,并且完成随访。2、经接受TTT手术治疗后糖尿病足患者足部CTA及CT灌注发现血管增多的现象,相关数据已经在英文期刊上发表。3、TTT术前、术后1个月糖尿病足局部创面边缘组织进行HE染色。HE分别对血管生成、肉芽组织生成、表皮和真皮再生三个方面进行评分,术前血管生成(1.000±0.000),术后血管生成(3.050±0.887),差异具有统计学意义(P<0.05)。术前肉芽组织生成(1.000±0.000),术后肉芽组织生成(3.000±0.794),差异具有统计学意义(P<0.05)。术前表皮和真皮再生(1.500±0.513),术后表皮和真皮再生(2.450±0.510),差异具有统计学意义(P<0.05)。由此可见,术后血管再生、肉芽组织生成及表皮和真皮再生均较术前明显增多。4、对糖尿病足局部创面进行血管相关标记物的免疫组化检测,术前CD31阳性细胞率(0.409±0.046)%,术后(1.205±0.049)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。术前SMA-α阳性率为(3.1205±0.942)%,术后(15.550±1.505)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。术后局部组织血管较术前明显增多。5、Elisa实验检测术前、术后1个月糖尿病足患者外周血血浆中VEGF、TGF-β1、PDGF-BB的含量变化。术前VEGF浓度为(282.8±19.79)pg/ml,术后浓度为(1089±29.55)pg/ml,差异具有统计学意义(P<0.05)。术前TGF-β1的浓度为(8.702±0.948)pg/ml,术后浓度为(33.85±5.463)pg/ml,差异具有统计学意义(P<0.05)。术前PDGF-BB的浓度为(344±45.94)pg/ml,术后浓度为(3153±971.7)pg/ml,差异具有统计学意义(P<0.05)。TTT手术后1个月血液中VEGF、TGF-β1、PDGF-BB的浓度均较术前明显增多。6、术前、术后1个月患者局部创面组织进行免疫组化检测VEGF、TGF-β1、PDGF-BB的含量。术前VEGFR-2的阳性细胞率为(0.495±0.037)%,术后为(2.819±0.264)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。术前TGF-β1的阳性细胞率为(3.063±0.167)%,术后(7.045±0.141)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。术前PDGF-BB的阳性细胞率为(2.912±0.131)%,术后为(6.886±0.146)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。TTT后糖尿病足局部组织VEGF、TGF-β1、PDGF-BB的含量均较术前明显增多。7、对局部组织进行内皮细胞标记物CD34进行免疫组化检测,术前阳性细胞率为(1.036±0.138)%,术后为(4.596±0.710)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。应用流式细胞检测外周血中EPCs的含量,通过其标记物CD34/CD133/CD309进行检测,其中术前CD34(0.813±0.066)%,术后(4.047±0.232)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。CD34+、CD133+、CD309+术前为(0.047±0.007)%,术后(0.522±0.042)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。TTT术后局部内皮细胞含量较术前明显增多,外周血中EPCs的含量也较术前明显增多,说明TTT可以激活EPCs的增殖和迁移,促进糖尿病足血管网络的形成与创面的愈合。8、对局部组织进行免疫组化检测Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的关键因子Ras、Raf、MEPK6/ERK3在局部组织中的含量。结果显示Ras术前阳性率为(1.655±0.674)%,术后阳性率为(13.195±3.093)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。Raf术前阳性率为(2.103±1.029)%,术后阳性率为(11.322±1.674)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。MEPK6/ERK3术前阳性率为(1.591±0.548)%,术后阳性率为(16.515±2.336)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。应用Western-blot检测局部创面新鲜组织中Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的关键因子Ras、Raf、MAPK6/ERK3的含量。结果显示术前Ras、Raf、MAPK6/ERK3的含量分别是(0.231±0.021)、(0.253±0.022)、(0.288±0.017),术后分别是(1.536±0.058)、(1.811±0.091)、(1.723±0.107),差异均具有统计学意义(P<0.05)。由此可得出,TTT术可以激活Ras/Raf/MEK/ERK信号通路促进糖尿病足创面血管网的再生修复。结论:1、TTT用于治疗糖尿病足患者,CTA及CT灌注证实溃疡创面边缘血管网络的再生,局部对血管标记物CD31及SMA-α含量增多进一步说明糖尿病足局部血管的增多,促进创面愈合。2、TTT可促进生长因子VEGF、PDGF-BB、TGF-β1的增多,促进血管再生及激活EPCs的增殖、迁移。3、TTT手术后患者外周血中EPCs明显增多,局部的内皮细胞也增多。说明可能激活了EPCs促进糖尿病足创面血管再生与修复。4、TTT术后Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的关键因子在糖尿病足创面边缘含量增多,说明TTT手术可能通过Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的级联反应促进血管的再生。