论文部分内容阅读
目的:采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氢吡啶（1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP）建立帕金森体外细胞模型,探讨Wnt/β-catenin信号通路在MPTP诱导的PC12细胞中的作用机制,进一步深入研究利多卡因是否通过Wnt/β-catenin信号通路在帕金森损伤中起保护作用,为帕金森的治疗提供理论依据。方法:采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基体外培养PC12细胞,给予C12细胞不同浓度0.2m M、0.4m M、0.8m M、1.6m M、3.2m M的MPTP和作用时间6h、12h、24h、48h,通过CCK8法筛选最佳MPTP作用浓度和时间,以建立体外帕金森模型。同时采用CCK8法和Western blot法筛选最佳利多卡因作用浓度和时间。实验分组为对照组、MPTP组、MPTP+利多卡因组、MPTP+利多卡因+DKK1组以及MPTP+DKK1组。然后采用流式细胞术检测各组PC12细胞ROS生成情况;ELISA法检测PC12细胞IL-1、IL-6、TNF-α的水平;Western blot法检测PC12细胞Wnt、β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β以及Caspase3的蛋白表达水平;Q-PCR法检测PC12细胞Wnt、β-catenin、GSK-3β的m RNA表达水平。结果:1.PC12细胞与MPTP共同孵育6h、12h、24h、48h,随着MPTP浓度升高,细胞存活率逐渐下降。与正常组相比较,0.2～3.2m M的MPTP的细胞存活率差异均有统计学意义（P＜0.05）。2.预实验结果确定Lidocaine作用浓度范围0.001mg/ml、0.01mg/ml、0.1mg/ml、1.0mg/ml分别作用1h、2h、6h、12h和24h。最终确定Lidocaine作用时间为6h,然后继续筛选Lidocaine作用浓度。与Control组相比,PC12细胞存活率在给与0.001～1.0mg/ml的Lidocaine后显著下降（P＜0.05）。当Lidocaine作用浓度为0.2 mg/ml时,P＜0.001;当Lidocaine作用浓度为≥0.4 mg/ml时,P＜0.0001。3.与正常组相比较,MPTP组细胞内ROS水平显著升高（P＜0.05）;而与MPTP组比较,MPTP+利多卡因组内ROS水平显著降低（P＜0.05）;与MPTP+利多卡因组相比,加入抑制剂DKK1时细胞内ROS产生量增加,差异具有统计学意义（P＜0.05）。4.与正常组相比较,MPTP组炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α产生均显著增加,（P＜0.05）;与MPTP组比较,MPTP+Lidocaine组IL-1β、IL-6、TNF-α产生均显著降低（P＜0.05）;与MPTP+Lidocaine组相比较,MPTP+Lidocaine+DKK1组炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的产生量显著增加,且差异具有统计学意义。5.与正常组比较,MPTP组细胞Wnt1和β-catenin蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）;与正常组比较,MPTP组细胞GSK-3β和Caspase3蛋白的表达水平显著升高（P＜0.05）。与MPTP组比较,MPTP+0.6mg/ml Lidocaine组β-catenin和Wnt1蛋白表达水平升高最为明显（P＜0.05）;与MPTP组比较,MPTP+0.6mg/ml Lidocaine组的GSK-3β蛋白的表达水平下降最为显著（P＜0.05）。6.与对照组相比,MPTP组Wnt、β-catenin蛋白表达量显著降低（P＜0.05）;GSK-3β、p-GSK-3β和Caspase3蛋白表达量显著升高（P＜0.05）。而与MPTP组相比较,在给予利多卡因治疗后Wnt、β-catenin蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）,GSK-3β、p-GSK-3β和Caspase3蛋白表达量显著降低（P＜0.05）。与MPTP+Lidocaine组相比,MPTP+Lidocaine+DKK1组Wnt、β-catenin蛋白显著下降,GSK-3β、p-GSK-3β和Caspase3蛋白表达量显著升高（P＜0.05）。7.与对照组相比,MPTP组Wnt、β-catenin的m RNA表达量显著降低（P＜0.05）;GSK-3β的m RNA表达量显著升高（P＜0.05）。而与MPTP组相比较,在给予多卡因治疗后Wnt、β-catenin的m RNA表达水平明显升高（P＜0.05）,GSK-3β的m RNA表达量显著降低（P＜0.05）。与MPTP+Lidocaine组相比,MPTP+Lidocaine+DKK1组Wnt、β-catenin的m RNA显著下降,GSK-3β的m RNA表达量显著升高（P＜0.05）。结论:1.MPTP和Lidocaine可降低PC12细胞存活率,并存在一定的时间-剂量反应关系。2.Lidocaine能降低MPTP诱导的PC12细胞内产生的ROS,并且该作用可被Wnt/β-catenin信号通路抑制剂DKK1抑制,这表明利多卡因可能是通过Wnt/β-catenin信号通路发挥防止氧化应激的产生,从而达到一定的保护作用。3.Lidocaine能降低MPTP诱导的PC12细胞内产生的炎症因子IL-1、IL-6以及TNF-α水平,并且该作用可被Wnt/β-catenin信号通路抑制剂DKK1抑制,提示利多卡因可能是通过Wnt/β-catenin信号通路发挥抗炎作用。4.Lidocaine能降低MPTP诱导的PC12细胞内凋亡蛋白Caspase3的表达水平,以及该作用可被DKK1抑制,说明Wnt/β-catenin信号通路参与了PC12细胞凋亡的过程。5.Lidocaine能激活MPTP诱导的PC12细胞内的Wnt/β-catenin信号通路并且抑制GSK-3β以及p-GSK-3β的蛋白及m RNA表达,从而达到氧化应激引起的帕金森损伤的保护作用。