大白菜杂种优势明显,主要利用自交不亲和系生产F1代杂交种。自交不亲和性比较强的亲本有利于提高杂交率,但自交繁种十分困难,导致具有优良性状的强自交不亲和系不能作为亲本,极大地限制了亲本的选择和选配。因此亟需对大白菜自交不亲和的调控机制进行系统解析,以提高自交不亲和系亲本的繁种效率,扩大亲本可选择范围。本研究发现大白菜自交不亲和反应由受体激酶FERONIA介导的活性氧（ROS）所调控,柱头ROS在自花授粉后升高抑制自花花粉的生长,而在异花授粉后降低促进异花花粉的生长。主要研究结果如下:1.柱头ROS自花授粉后上升,异花授粉后下降用H-2DCFDA对自花和异花授粉后不同时间的柱头进行染色,发现自花授粉后5min,柱头ROS就迅速上升,30 min到达最高水平,是未授粉柱头的3倍;而异花授粉后5-30 min,柱头ROS持续下降。同时发现,柱头ROS升高与降低的时间点与自花花粉受抑制及异花花粉水合、萌发、进入柱头的时间点是高度吻合的,表明柱头ROS的升高和降低分别是自花和异花授粉诱导的特异性反应。在柱头离体培养系统中加入反义寡核苷酸,抑制自花花粉识别的雌蕊决定因子SRK的表达,结果发现AS-Br SRK46处理特异性降低S46单元型大白菜柱头中Br SRK46的表达量;并有效打破自交不亲和,促进自花花粉的生长,这说明反义寡核苷酸是瞬时抑制大白菜柱头特异基因表达的有效方法。更重要的是,AS-Br SRK46处理有效阻止自花授粉引起的柱头ROS升高,说明自花授粉后柱头ROS的升高依赖于自花花粉识别。2.柱头高水平的ROS抑制自花花粉的萌发和生长在柱头离体培养系统中,加入不同种类的ROS清除剂改变柱头ROS含量,以研究柱头ROS与自交不亲和的关系。结果发现,超氧阴离子清除剂CuCl2、Tiron,过氧化氢清除剂KI,羟自由基清除剂苯甲酸钠,都能显著降低柱头ROS,有效打破自交不亲和,且呈浓度依赖性,说明柱头ROS是维持自交不亲和所必需的。另一方面,在柱头上施加超氧化物的产生剂X/XO或羟自由基的产生剂Fe SO4,都升高柱头ROS,抑制亲和花粉的生长,说明柱头ROS是抑制花粉生长的充分条件。这些结果表明柱头ROS是抑制自花花粉的充分必要因素。为了进一步探究高水平的ROS对自花花粉的影响,本研究发明了柱头转移试验。在柱头转移实验中,通过将自花授粉0 min,15 min,30 min,60 min的柱头分别转移到含有ROS清除剂CuCl2的培养基中,观察自花花粉的生长状态。结果发现,授粉后马上转移的柱头,其自花花粉的生长受抑制的程度比较小,而授粉后15 min-30 min才转移的柱头,其自花花粉的生长受到了严重的抑制,授粉后60 min才转移的柱头,自花花粉全部失去了再萌发的能力,说明自花花粉诱导的ROS对其本身造成了不可逆的损伤。本研究检测了单个柱头进行双授粉（自花或异花授粉）后的ROS变化,模拟自然授粉。同时（0 min）或间隔15 min的双授粉都表明自花授粉一侧没有花粉管穿过柱头,异花授粉一侧成束的花粉管穿过柱头。此外,自花和异花授粉都引发了柱头ROS变化,导致自花授粉一半的ROS水平升高,异花授粉一半的ROS水平降低。与上述一致的是,同一个柱头一半自花或异花授粉与另一半未授粉相比,自花授粉一半导致ROS升高,异花授粉一半导致ROS降低。以上结果表明在自然授粉过程中,自花和异花花粉同时落到同一个柱头上时,自花花粉不影响异花花粉萌发和生长。3.FERONIA受体激酶-Rac/Rops-Rbohs信号通路调控自交不亲和反应用NADPH氧化酶的特异性抑制剂DPI处理柱头,有效降低柱头ROS,打破自交不亲和,说明NADPH氧化酶参与调控自交不亲和中ROS产生。大白菜柱头中,NADPH氧化酶的编码基因BrRbohD1、BrRbohD2、Br Rboh F、Br Rboh I表达量比较高;用相应的反义寡核苷酸分别抑制这四个Br Rbohs表达,有效降低柱头ROS并打破自交不亲和,促进自花花粉的生长。进而,用DPI处理十字花科其他植物如羽衣甘蓝和萝卜的柱头,也能够降低柱头ROS并打破自交不亲和,说明NADPH氧化酶调控的ROS产生是十字花科植物抑制自花授粉的保守而通用的机制。自花授粉和异花授粉后1 min,3 min就引起柱头ROS的升高和降低,且自花授粉和异花授粉5 min引起柱头NADPH氧化酶酶活性的显著升高和降低,表明NADPH氧化酶的活性受到精细调控。在柱头离体培养系统中加入Rac/Rop GTP酶的抑制剂GDP,有效降低柱头ROS并打破自交不亲和,说明Rac/Rop GTP酶参与调控自交不亲和。Br ROP2是大白菜柱头中高表达的Br ROP,AS-Br ROP2处理柱头能降低柱头ROS且打破自交不亲和。酵母双杂交实验及pull-down实验都发现,Br ROP2与Br Rboh F互作,说明BrROP2是自交不亲和过程中调控NADPH氧化酶的主要调控因子。Pull-down实验发现,Br ROP2与Br FER1互作。AS-Br FER1处理大白菜柱头,降低柱头ROS,打破自交不亲和。综合以上实验表明柱头ROS是通过FERONIA受体激酶-Rac/Rops-Rbohs信号通路产生。4.FERONIA受体激酶-Rac/Rops-Rbohs信号通路调控亲和反应分别用AS-BrFER1、AS-Br ROP2、AS-BrRbohF处理大白菜柱头时,发现降低这三个基因的表达也降低了未授粉柱头的ROS。进而发现,用AS-Br FER1、AS-Br ROP2、AS-Br Rboh F处理大白菜柱头后异交授粉,或在拟南芥fer和rboh D突变体柱头上直接授粉,都显著促进亲和花粉的萌发和生长。结合异花授粉后柱头ROS降低,综合以上结果表明FERONIA受体激酶-Rac/Rops-Rbohs信号通路调控产生的ROS对亲和花粉也有一定的抑制作用。本研究通过FERONIA受体激酶-Rac/Rops-Rbohs信号模块,解析ROS调控自交不亲和的分子机制,为进一步解析自交不亲和的分子机制提供新的见解,而且对自交不亲和育种技术的改良具有重要的理论意义。