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连作障碍制约我国苹果产业健康可持续发展,寻求绿色、高效的防控措施是防控苹果连作障碍的理想途径。生物防治是苹果连作障碍防控的重要途径之一。本研究探讨了27个老龄苹果园连作障碍的严重程度与丛枝菌根真菌（AMF）多样性的相关性,分离鉴定出一株高效AMF菌株并对其防控效果进行验证,分析了接种AMF苹果砧木抵御腐皮镰孢菌侵染的生理和分子机制。同时,从接种AMF苹果砧木M9T337中筛选并克隆了一个响应腐皮镰孢菌侵染的基因—Md WRKY40,并对其功能进行了探究。主要研究结果如下:1.探讨了老龄苹果园土壤中丛枝菌根真菌多样性与连作障碍严重程度的关系。线性回归结果显示,老龄苹果园土壤AMF的香农指数与苹果幼苗干重抑制率呈显著负相关（P＜0.05）。冗余分析和典型对应分析表明,有效磷和总氮是AMF多样性和群落结构的负向驱动因素。结构方程模型表明,27份土壤样品中有效磷、总氮、总磷的含量通过影响AMF的多样性,间接影响了连作苹果幼苗干重抑制率。这些结果表明,土壤有效磷和总氮含量可以通过改变老龄苹果园土壤中AMF的多样性和群落结构来间接影响苹果连作障碍的严重程度。2.研究了在连作土壤中接种土著AMF提高苹果砧木抗性的生理效应。连作条件下,接种土著AMF可提高苹果砧木M9T337的生物量,促进根系生长,且苹果根系的抗氧化酶和防御相关酶活性显著提高,包括超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶;苹果根系的H2O2含量和·O2-产量降低,脂质氧化程度降低。这表明,在连作土壤中,接种土著AMF通过诱导苹果砧木产生多种抗性相关酶来增强对连作环境的适应性。3.筛选鉴定出一株高效AMF菌株。采用湿筛法分离出一株土著丛枝菌根真菌,根据其形态特征和系统发育分析,鉴定该菌为类球囊霉属（Paraglomus sp.）真菌,命名为Paraglomus sp.SW1。目前该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC NO.20744。4.验证了高效AMF菌株对苹果连作障碍的防控效果。盆栽试验结果表明,与连作对照相比,接种SW1可显著提高苹果砧木的生物量,提高植物体内的防御相关酶活性。通过真菌ITS和丛枝菌根真菌18S SSU r RNA扩增子测序发现,苹果砧木接种SW1显著改变土壤真菌和丛枝菌根真菌群落结构,与连作对照相比,接种SW1苹果砧木的土壤真菌群落中球囊霉门（Glomeromycota）丰度显著提高,镰孢菌属丰度显著降低。荧光定量结果表明苹果砧木接种SW1显著降低土壤中层出镰孢菌、腐皮镰孢菌和串珠镰孢菌的基因拷贝数,提高土壤中真菌和AMF丰度。田间试验结果表明,接种SW1促进了重茬果园连作苹果幼树的生长,改变了连作土壤环境和微生物群落结构。SW1接种处理显著提高了沂源、栖霞、莱州三个试验点的连作苹果幼树生物量,建园当年三个试验点连作苹果幼树株高分别比连作对照提高了16.3%、15.4%和15.7%;SW1接种处理有效提高了连作果园土壤中细菌、真菌、放线菌总量。q PCR结果表明SW1接种处理显著提高土壤中真菌和AMF丰度,降低层出、腐皮和串珠镰孢菌的基因拷贝数,末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）分析表明SW1接种处理提高了土壤真菌和丛枝菌根真菌多样性,改变了连作土壤的微生物群落结构。相关性分析表明,植物生长状况与与细菌、放线菌、脲酶、过氧化氢酶、p H、有机质含量呈显著正相关,与层出、腐皮、串珠镰孢菌的基因拷贝数呈显著负相关。5.解析了接种SW1苹果砧木抵御腐皮镰孢菌侵染的防御机制。实验结果表明,腐皮镰孢菌侵染显著降低了苹果砧木的干重,接种SW1的苹果砧木在腐皮镰孢菌侵染下根系受到的损伤较小。接种SW1还增强苹果砧木根系抗氧化酶的活性,减轻根系膜脂的氧化程度。利用转录组测序分析了腐皮镰孢菌侵染接种和未接种SW1的苹果砧木抵御腐皮镰孢菌侵染的转录表达谱,共获得1839个差异表达基因（DEG）。GO富集分析表明,大量的差异表达基因富集到二磷酸腺苷（ADP）的结合和钙离子的结合途径。KEGG通路分析表明,差异表达基因主要富集于植物-病原体相互作用、糖酵解和糖异生、MAPK信号传导等途径。此外,Map Man可视化分析发现大量差异表达基因富集到接种SW1苹果砧木对腐皮镰孢菌侵染的生物胁迫响应。这表明,接种SW1苹果砧木M9T337通过诱导根系抗性系统来响应腐皮镰孢菌的侵染。6.筛选了一个接种SW1苹果砧木响应腐皮镰孢菌侵染的基因——Md WRKY40（MD15G1039500）。根据WRKY结构域和锌指基序特征,Md WRKY40属于WRKY IIa组。亚细胞定位分析发现Md WRKY40定位于细胞核。在苹果王林愈伤组织中过表达Md WRKY40基因后,显著降低了腐皮镰孢菌的菌丝延伸率,这说明过表达Md WRKY40苹果愈伤组织能够显著提高对腐皮镰孢菌侵染的抗性。在腐皮镰孢菌侵染苹果根系过程中,β-1,3-葡聚糖酶基因（Md GLU）在过表达Md WRKY40的苹果愈伤组织中显著上调。酵母单杂交和电泳迁移率试验表明Md WRKY40和Md GLU启动子结合。根据荧光素酶报告分析,Md WRKY40显著提高Md GLU启动子活性。综上,Md WRKY40通过结合葡聚糖酶基因的启动子,促进其表达,从而提高苹果砧木对腐皮镰孢菌侵染的抗性。