【摘 要】
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研究背景和目的:免疫性血小板减少症(Immune thrombocytopenia,ITP)是一种获得性的自身免疫性疾病,主要以皮肤粘膜不同程度的出血、外周血中血小板减少等为特征。ITP发病机制复杂,现在普遍认为体液免疫紊乱、细胞免疫失衡、巨核细胞成熟障碍等机制共同参与该病的发生发展。有研究证实,在Ets-1缺陷小鼠体内,Th17细胞数量明显增加,而Treg细胞出现功能性发育障碍[1-2]。在IL
【基金项目】
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2017年国家自然科学基金(项目号:81770115)《E3泛素连接酶HUWE1在免疫性血小板减少性紫癜Treg/Th17免疫失衡中的作用和机制研究》;
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研究背景和目的:免疫性血小板减少症(Immune thrombocytopenia,ITP)是一种获得性的自身免疫性疾病,主要以皮肤粘膜不同程度的出血、外周血中血小板减少等为特征。ITP发病机制复杂,现在普遍认为体液免疫紊乱、细胞免疫失衡、巨核细胞成熟障碍等机制共同参与该病的发生发展。有研究证实,在Ets-1缺陷小鼠体内,Th17细胞数量明显增加,而Treg细胞出现功能性发育障碍[1-2]。在IL-6和TGF-β刺激下,Ets-1促进Th17细胞分泌更多的IL-17;在Treg细胞中,Ets-1通过调节Foxp3的稳定表达影响其发育和功能[3]。因此认为Ets-1是调节Th17/Treg细胞间平衡的关键因子,恢复Ets-1表达和活性成为自身免疫性疾病治疗的新研究热点。我们前期的研究证实,ITP患者的外周血CD4+T细胞中E3泛素连接酶HUWE1高表达,并与血小板计数呈负相关;HUWE1敲除后Treg细胞比例增加并促进Treg细胞对效应细胞的增殖抑制作用,即ITP患者外周血CD4+T细胞中HUWE1的mRNA水平与Treg所占比例呈负相关。所以本课题旨在通过多种分子生物学研究方法和基因修饰小鼠,从细胞水平和模型动物水平探究E3泛素连接酶HUWE1如何通过Ets-1影响Th17/Treg细胞比例,导致ITP疾病的发生发展。研究方法:采用Western Blot(WB)检测ITP患者外周血CD4+T细胞中Ets-1的水平;Co-immunoprecipitation(Co-IP)、WB分别检测MEK-ERK激活状态、Ets-1 磷酸化状态对HUWE1与Ets-1结合的影响,探讨HUWE1与Ets-1的相互作用机制;通过Co-IP、WB检测转染后Jurkat T细胞的HUWE1、Ets-1表达情况;WB检测HUWE1、Ets-1、MEK1的表达情况,探讨HUWE1对Ets-1蛋白泛素化降解的影响。用Lenti-GFP、Lenti-HUWE1和/或Lenti-Ets-1 转染na?veCD4+ T细胞,采用 qRT-PCR、流式检测Foxp3表达量和Treg细胞的比例;流式检测与Treg共培养后效应T细胞增值情况。构建ITP小鼠模型,腹腔注射HUWE1抑制剂BI8622,采用血小板计数方法检测血小板数量的变化;流式检测小鼠脾脏中Treg细胞百分比;WB检测Ets-1和p-Ets-1的表达情况;Co-IP、IB检测ITP小鼠脾脏中na?veCD4+T细胞内HUWE1与Ets-1之间的相互作用。结果:ITP患者外周血CD4+T细胞HUWE1的表达水平与Ets-1蛋白表达水平呈负相关;HUWE1过表达会降低Ets-1蛋白的表达,蛋白酶体抑制剂可解除HUWE1的抑制作用;CD4+T细胞中HUWE1过表达抑制Treg细胞分化,但其对Th17细胞的分化无影响;ITP小鼠模型证实HUWE1抑制剂对ITP具有缓解作用。结论:HUWE1通过促进Ets-1泛素化,抑制Treg细胞分化,参与ITP的发病。
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