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研究背景哮喘(asthma)是一种常见的慢性炎症性疾病,主要特点包括气道炎症、气道高反应性和气道重塑。目前全球有至少3亿人患有哮喘,且发病率呈逐年上升趋势。因此哮喘逐渐成为一个棘手的公共卫生难题。哮喘气道结构的改变称为哮喘气道重塑,是哮喘重要的病理特征,其主要包括细胞外基质(ExtraCellular Matrix,ECM)的改变、基底膜增厚、上皮细胞化生、气道平滑肌细胞增多和血管数量的增多。气道平滑肌细胞(airway smoothmuscle cells,ASM)在哮喘中起重要作用,主要包括:(1)收缩和舒张气道;(2)是细胞因子、趋化因子及ECM蛋白的主要来源;(3)是β受体激动剂(β-agonist)作用的主要靶点。而气道平滑肌细胞的增加及向上皮细胞层的迁移是引起哮喘气道阻塞的主要原因。血管生成(angiogenesis)是哮喘气道重塑的另一个重要特征,指在原来存在的血管基础上新生血管的生成,主要由促血管生成因子和抗血管生成因子调节。在哮喘中,多种促血管生成因子如血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)、促血管新生蛋白因子等的表达较健康个体增加,而促血管生成因子和抗血管生成因子平衡的打破是引起血管生成增强或减弱的主要机制。血管生成被认为是哮喘严重程度进展的重要机制,血管增加的数量与哮喘的严重程度呈正相关。结缔组织生长因子(Connective Tissue Growth Factor,CTGF)是 VEGF 活性的重要调节剂,CTGF及VEGF165均由气道平滑肌细胞释放,并共同定位于ECM中。CTGF可与多种促血管生成因子如血小板衍生因子(platelet derived growth factor,PVDF)、VEGFa 及转化生长因子-β(TransformingGrowthFactor-β,TGF-β)。除此以外,CTGF对许多生理功能如损伤修复、细胞的迁移和增生、细胞粘附和骨骼生长起重要作用,CTGF还可以诱导ECM蛋白如纤维粘连蛋白(fibronectinl,FN-1)的表达。而CTGF在气道平滑肌细胞中的表达主要通过TGF-β诱导。TGF-β与其受体结合后使Smads(包括Smad2/3)发生磷酸化,磷酸化的Smad2/3转移至细胞核中,与靶基因的Smad结合元件(Smad binding element,SBE)识别并结合,调节基因的转录。有研究表明在小鼠成纤维细胞中,TGF-β诱导的CTGF的表达是通过Smads结合SBE后增强了 CTGF的转录水平,进一步诱导了 CTGF的表达。Smads有许多可以与之结合的因子,通过与这些共刺激/抑制因子的结合来调节其转录活性,其中之一为Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor2,Runx2)。Runx2调节成骨基因表达的重要转录因子,可结合其它启动子区域激活转录。在血管平滑肌细胞中,Runx2可在转录水平抑制TGF-β诱导的CTGF的产生。而在哮喘气道平滑肌细胞TGF-β诱导的CTGF的表达调节尚未有研究报道,且Runx2在哮喘气道平滑肌细胞中的表达特点及转录调节亦尚未研究。本课题通过运用CTGF启动子荧光素酶报告克隆质粒转染原代非哮喘及哮喘病人来源的气道平滑肌细胞,探讨CTGF在转录水平的调节;同时通过Runx2在小鼠过敏性气道疾病模型肺组织、健康及哮喘患者肺组织和气道活检组织中的表达特点及在哮喘气道平滑肌中的转录调节作用明确Runx2的重要作用。研究方法:1.实验动物模型中CTGF及Runx2的表达:小鼠过敏性气道疾病模型肺组织由Newcastle大学Philip Hansbro教授赠与;羊过敏性气道疾病模型肺组织由Melbourne大学Kenneth J Snibson教授赠与;通过免疫组织化学检测CTGF和Runx2在动物模型中的表达。2.非哮喘及哮喘患者肺组织中的CTGF及Runx2的表达:人肺组织由澳大利亚悉尼市St Vincent’s医院、Strathfield私立医院、RoyalPrince Alfred医院的提供的手术后肺组织或者肺移植后肺组织;通过免疫组织化学检测CTGF和Runx2在人肺组织中的表达。3.气道平滑肌细胞的培养及TGF-β 1的刺激:分离并培养非哮喘及哮喘患者气道平滑肌细胞,给与人重组TGF-β1刺激后,检测CTGF、Runx2和Smad3mRNA及蛋白在非哮喘及哮喘患者气道平滑肌细胞中的表达,同时检测Runx2和Smad3活化后在细胞中的移动。4.CTGF转录水平及转录后水平的调节:CTGF启动子荧光素酶报告克隆质粒转染原代非哮喘及哮喘病人来源的气道平滑肌细胞后加入TGF-β1刺激,上清液用于荧光素酶的测定进行转录水平调节的测定,同时提取细胞mRNA进行CTGF mRNA的检测。原代气道平滑肌细胞加入TGF-β 1刺激后,加入actinomycin D终止细胞内mRNA的合成,不同时间点检测剩余CTGF mRNA的表达,测定CTGF mRNA在哮喘及非哮喘气道平滑肌细胞中的半衰期。5.Runx2及其异构体在气道平滑肌细胞中对CTGF、VEGFa、FN-1、IL-6的影响。Runx2异构体长1、1和2的质粒转染进入永生化哮喘气道平滑肌细胞中,加入TGF-β1刺激后检测 CTGF、VEGFa、FN-1、IL-6mRNA 的表达。6.CTGF mRNA在健康及哮喘患者气道活检组织中的表达及与哮喘基底膜厚度、FEV1%、痰嗜酸性粒细胞、PC20的关系。实验中所用活检标本及临床资料来源于NORM研究,活检组织提取RNA,通过RNA测序检测CTGF mRNA的表达,建立CTGF与BM、FEV1%、痰嗜酸性粒细胞、PC20的直线模型。研究结果:1.过敏性气道疾病动物模型肺组织中CTGF及Runx2的表达:CTGF在对照组和HDM诱导的的羊模型气道中均有表达,主要分布于气道平滑肌细胞层,HDM组的表达较对照组增加。在对照小鼠OVA诱导的小鼠过敏性气道疾病模型中,Runx2主要表达于上皮细胞层,在平滑肌层也有表达,在OVA组小鼠的气道平滑肌细胞中罕见Runx2的表达,但因对照组小鼠的气道平滑肌较难分辨,我们不能将对照组与OVA组进行比较。2.非哮喘及哮喘患者肺组织中的CTGF及Runx2的表达:CTGF蛋白表达于人气道平滑肌区域,且在重度哮喘患者中的表达增加。Runx2主要表达于上皮细胞层,在平滑肌层也有表达,将气道平滑肌区域进行放大,可以看到Runx2在非哮喘患者的气道平滑肌细胞浆和细胞核中均有表达,而在哮喘气道平滑肌中的几乎不表达3.气道平滑肌细胞TGF-β1刺激后CTGF、Runx2和Smad3的表达:TGF-β1刺激哮喘和非哮喘气道平滑肌细胞后,在两种细胞中均可看到CTGF的诱导表达,但CTGF mRNA在哮喘气道平滑肌细胞中的表达在12h和24h比非哮喘细胞中分别高3倍和2.5倍。非哮喘气道平滑肌细胞中Runx2在TGF-β1刺激8h和12h后表达增高,而在哮喘气道平滑肌细胞表达无变化,Smad3mRNA的表达在非哮喘和哮喘气道平滑肌中的表达降低,但是两者之间无统计学差异。TGF-β1刺激后,与非哮喘相比,哮喘气道平滑肌细胞中更多的p-Smad3转移至细胞核中,但我们并未发现Runx2随着p-Smad3共同转运至细胞核中。4.CTGF转录水平及转录后水平的调节:CTGF基础启动子活性(无TGF-β刺激)在非哮喘和哮喘可见于-400到+200启动子片段,而启动子的活性在哮喘和非哮喘气道平滑肌细胞中无统计学差异。而转录后水平的调节显示:非哮喘中,CTGFmRNA半衰期约为3h(而在哮喘中,CTGF mRNA的半衰期明显延长(约为7h),表明CTGF mRNA在哮喘气道平滑肌细胞中更稳定。5.Runx2及其异构体在气道平滑肌细胞中对CTGF、VEGFa、FN-1、IL-6的影响。无TGF-β1 刺激时,CTGF、FN-1、VEGFa 和 IL-6mRNA 的表达在 Runx2 异构体转染前后并未发生改变。加入TGF-β1刺激12h后,Runx2异构体1转染组CTGF的表达明显降低,但是在24h时表达又上升。Runx2异构体对FN1、VEGFa和IL-6 mRNA的表达未见明显作用。6.CTGFmRNA在健康及哮喘患者气道活检组织中的表达及与哮喘基底膜厚度、FEV1%、痰嗜酸性粒细胞、PC20的关系。CTGF mRNA的表达在哮喘和非哮喘气道平滑肌活检组织中无统计学差异,CTGF的表达与基底膜厚度相关,与FEV1%、气道高反应性和痰嗜酸性粒细胞的水平无关。结论1.哮喘气道平滑肌细胞中TGF-β信号通路的转导中比非哮喘细胞中增强;2.CTGF基础启动子活性气道平滑肌细胞中位于-400到+200启动子片段;与其它类型细胞相比,CTGF在肺组织中存在独特转录水平的调节;3.除了转录水平的调节,CTGF在气道平滑肌细胞也收到转录后水平(mRNA稳定)的调节;4.CTGF的表达与基底膜厚度相关表明平滑肌细胞来源的CTGF表达可能影响哮喘气道的狭窄和重塑,为未来研究哮喘新的治疗靶点提供了理论支持。5.TGF-β诱导的Runx2表达增加仅发生于非哮喘气道平滑肌细胞中,且Runx2可抑制TGF-β诱导的CTGF的表达,为将来哮喘的治疗提供了新的靶点。