论文部分内容阅读
目的:肿瘤是全球死亡的主要原因之一。在我国,无论男性还是女性,肺癌仍然是病死率最高的肿瘤类型。非小细胞肺癌(Non Small Cell Lung Cancer,NSCLC)约占所有肺癌的85%。放射治疗不仅是非小细胞肺癌的辅助治疗手段,也是无法治愈患者的重要姑息治疗方式。然而,肿瘤内部乏氧和干细胞特性诱发的辐射抗性是患者预后不良的重要原因。已有研究报道活性维生素D[1α,25-dihydroxyvitamin D3,1α,25(OH)2D3]具有肿瘤辐射增敏作用。但是,1α,25(OH)2D3对乏氧肿瘤细胞是否有辐射增敏作用的研究仍不多见。因此,本研究以NSCLC为研究对象,分析1α,25(OH)2D3对乏氧肿瘤的辐射增敏作用,并初步探究可能的分子机制,为活性维生素作为潜在放疗增敏剂提供可靠的实验数据。方法:本课题分为两个部分。(1)1α,25(OH)2D3提高乏氧肺癌细胞的辐射敏感性:本课题通过乏氧小室系统控制氧浓度为1%,培养A549、H460和HCC827等肺癌细胞,使用Western blotting实验检测乏氧诱导因子(Hypoxia inducible factor,HIF1α)蛋白,Real-time PCR检测HIF1α下游靶基因VEGF,以验证细胞乏氧模型;利用CCK-8实验检测100 nmol/L 1α,25(OH)2D3联合0、2、4、6 Gy等不同剂量X-ray对乏氧肺癌细胞存活的影响,确定1%氧浓度培养细胞24 h和4 Gy X-ray照射条件分别为本课题的单独处理因素和联合因素。Western blotting实验检测乏氧肺癌细胞在不同处理因素后关键蛋白HIF1α及HIF2α表达水平,体外实验分析1α,25(OH)2D3对乏氧肺癌细胞的辐射增敏作用。通过接种A549细胞于裸鼠皮下,使移植瘤体积达到200 mm3左右,建立体内肿瘤乏氧模型,分为未治疗对照组、1α,25(OH)2D3治疗组(小鼠腹腔隔天注射0.5μg/kg)、10 Gy X-ray精准照射组以及两者联合治疗组,定期测量小鼠体重和皮下瘤体积,观察小鼠一般生理状态;利用光声成像实验分析皮下移植瘤内部氧饱和度的变化;免疫组化实验检测乏氧探针表达水平,以探究不同处理组乏氧程度差异,根据肿瘤内乏氧程度不同分为常氧区与乏氧区,利用Image J(National Institutes of Health,1.8.0)软件对Ki67和相关蛋白的变化进行评分,体内实验分析1α,25(OH)2D3对乏氧肿瘤的辐射增敏作用。(2)1α,25(OH)2D3抑制X-ray照射乏氧肺癌细胞的干细胞和衰老相关特性:活性维生素D主要通过与其受体(Vitamin D Receptor,VDR)结合调控靶基因发挥作用。因此,本部分实验利用Western blotting检测乏氧肺癌细胞在不同处理因素后VDR表达的变化;利用悬浮球成球实验,检测1α,25(OH)2D3对乏氧肺癌细胞照射后干细胞成球率的影响;Western blotting检测干细胞特性Nanog、Sox2以及E-Cadherin等相关蛋白的变化;通过细胞衰老β-半乳糖苷酶染色实验,检测1α,25(OH)2D3对乏氧肺癌细胞照射后衰老情况的影响,Western blotting检测衰老相关蛋白p21的表达水平,体外实验初步探究1α,25(OH)2D3对乏氧肺癌细胞辐射增敏的可能机制。使用第一部分研究建立的体内肿瘤乏氧模型,免疫组化检测不同处理组肿瘤组织内常氧和乏氧区Nanog和p21表达变化,体内实验初步探究1α,25(OH)2D3对乏氧肺癌细胞辐射增敏的可能机制。结果:1.1α,25(OH)2D3提高乏氧肺癌细胞的辐射敏感性Western blotting实验结果显示,A549、H460和HCC827等多种肺癌细胞乏氧处理24 h后,HIF1α蛋白显著升高(p<0.05);Real-time PCR实验结果显示,与永生化人支气管上皮细胞相比较,除了 HCC827细胞,其他肺癌细胞的HIF1α和HIF2α的mRNA表达明显较少(p<0.001),提示不同肺癌细胞HIF1α、HIF2α蛋白和mRNA本底值不同。当裸鼠皮下移植瘤体积达到200 mm3左右时,免疫组化检测乏氧探针的变化,结果显示肿瘤组织乏氧特性增加(p<0.05),以上结果表明本课题成功建立肿瘤细胞体外乏氧模型和体内肿瘤乏氧模型。平板克隆形成实验结果显示,A549细胞体外乏氧24和48 h后,细胞存活能力显著高于正常氧条件培养的细胞(p<0.05),HIF1α和HIF2α蛋白也明显增加(p<0.05),说明肺癌细胞乏氧后辐射抗性增加;CCK-8实验结果显示,与0、2、4、6 Gy X-ray单独照射组相比,1α,25(OH)2D3联合照射组的A549及H460细胞活力明显下降(p<0.05),照射后48 h下降更为显著(p<0.01),联合组HIF1α和HIF2α蛋白表达也明显减少(p<0.05)。以上实验结果表明,1α,25(OH)2D3提高体外乏氧肺癌细胞的辐射敏感性。裸鼠皮下移植瘤实验结果显示,与X-ray单独照射组相比,1α,25(OH)2D3联合照射组和肿瘤生长速度减缓(p<0.01);光声成像结果显示,肿瘤内部氧饱和度增加(p<0.05);免疫组化结果显示,肿瘤乏氧标志物Hypoxyprobe减少(p<0.05);无论常氧区还是乏氧区,增殖指标Ki67表达均降低(p<0.01)。以上体内和体外实验结果表明,1α,25(OH)2D3提高体内乏氧肺癌细胞的辐射敏感性。2.1α,25(OH)2D3抑制X-ray照射乏氧肺癌细胞的干细胞和衰老相关特性为了证实1α,25(OH)2D3是否通过改变VDR的表达发挥功能,本部分研究首先观察不同处理因素对VDR表达的影响,Western blotting实验结果显示,A549细胞乏氧后VDR表达明显减少(p<0.01),1α,25(OH)2D3单独处理和联合照射组细胞VDR表达明显升高(p<0.05);悬浮球成球实验结果显示,与单独X-ray照射组相比,1α,25(OH)2D3联合照射组,A549细胞成球率明显降低(p<0.05),H460细胞有同样的趋势,并且悬浮球体积也减小。同时,干性相关蛋白Nanog和Sox2表达有所降低(p>0.05),上皮相关蛋白E-Cadherin有所升高(p>0.05),没有统计学意义。细胞衰老β-半乳糖苷酶染色实验结果显示,与X-ray单独照射组相比,1α,25(OH)2D3联合照射组衰老细胞数量减少(p<0.01),衰老相关蛋白p21的表达水平明显降低(p<0.05),联合组细胞总数也明显减少(p<0.05)。免疫组化结果显示,与单独X-ray照射组相比,联合组乏氧肿瘤组织Nanog表达水平明显减少(p<0.05),p21变化不明显,而常氧区肿瘤组织Nanog和p21表达变化均不明显(p>0.05)。第二部分实验结果表明,1α,25(OH)2D3显著提高乏氧细胞VDR的表达,抑制X-ray照射乏氧肺癌细胞的干细胞特性和衰老相关特性,与抑制Nanog和p21表达水平有关。结论:1α,25(OH)2D3提高乏氧肺癌细胞的辐射敏感性与抑制X-ray照射乏氧肺癌细胞的干细胞和衰老相关特性有关。