论文部分内容阅读
第一部分大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及低氧预处理模型的建立目的：全骨髓细胞贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs),采用氯化钴(CoCl2)建立化学低氧预处理BMSCs实验模型。方法：采用全骨髓细胞贴壁法分离培养BMSCs,倒置显微镜下观察细胞形态及生长过程,取第3-4代细胞用于实验。体外标准诱导下检测此类细胞成脂、成骨等多向分化能力,并以流式细胞仪检测其表面标志物CD29、CD90、CD45。分别采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和流式细胞仪,检测不同CoCl2浓度(0、50、100、150、200、300、400、600μmol/L)和不同培养时间(0h、6h、12h、24h、48h、72h)培养条件下BMSCs的增殖和凋亡情况,确立CoC12化学低氧预处理BMSCs实验模型。结果：1.原代细胞呈梭形或不规则形,贴壁集落生长,贴壁细胞经3次传代后,细胞大小及形态趋于一致,呈长梭形、放射状生长。2.在标准成脂诱导条件下,油红染色证实其可向脂肪细胞分化；在标准成骨诱导条件下,茜素红染色证实其可向成骨细胞分化：流式细胞仪检测细胞表面抗原,结果显示CD29和CD90高表达,CD45低表达,符合骨髓间充质干细胞免疫表型。3.细胞培养液中CoCl2终浓度不超过200μmol/L、培养时间不超过24h对BMSCs的增殖和凋亡无明显影响。结论：1.全骨髓细胞贴壁培养法可获得较高纯度的大鼠BMSCs,满足体外实验要求。2.本研究最佳低氧预处理BMSCs实验模型为细胞培养液CoCl2终浓度200μmol/L、培养时间24h。第二部分低氧预处理对大鼠骨髓间充质干细胞体外迁移能力的影响及其机制研究目的：观察低氧预处理对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外迁移能力影响,并初步探讨其机制。方法：体外分离培养大鼠BMSCs,取第3-4代细胞用于实验。分别运用siRNA技术沉默低氧诱导因子-1α(Hypoxia-indue ible factor-1, HIF-la)基因或使用趋化因子受体4(Chemokine receptor4, CXCR4)抑制剂AMD3100,将细胞分成4组：常氧培养组(N组)、低氧预处理组(H组)、低氧预处理+HIF-1αRNA干扰组(HR组)及低氧预处理+ADM3100干预组(HA组)。运用细胞划痕实验及Transwell细胞迁移实验检测低氧预处理对大鼠BMSCs体外迁移能力的影响。Western blot和Real-time PCR检测低氧预处理BMSCs后HIF-1α和CXCR4蛋白及mRNA表达。结果：1.细胞划痕实验及Transwell细胞迁移实验发现低氧预处理组BMSCs细胞迁移能力较常氧培养组明显增强[划痕试验：(0.396+0.018)mm比(0.200+0.011)mm, Transwell细胞迁移实验：(21.0±4.5)比(8.5±1.7),P值均<0.05]；低氧预处理组BMSCs经HIF-1α基因沉默后或经AMD3100处理后细胞迁移能力较低氧预处理组明显降低(P<0.05),但与常氧培养组相比无明显差异(P>0.05)。2.低氧预处理组HIF-1α及CXCR4蛋白及mRNA表达明显高于常氧培养组(P<0.05)；HIF-1α基因沉默BMSCs经低氧预处理后其HIF-1α及CXCR4蛋白及nRNA表达明显低于单纯低氧预处理组(P<0.05)。结论：1.低氧预处理可使BMSCs的HIF-1α及CXCR4表达增加,抑制HIF-1α表达后CXCR4表达亦下降。2. CoCh诱导的化学低氧预处理可促进BMSCs的体外迁移能力,其机制可能与低氧预处理后HIF-1α表达上调进而介导CXCR4转录增加有关。第三部分低氧预处理骨髓间充质干细胞颈动脉注射移植治疗大鼠急性缺血性肾损伤的实验研究目的：探讨低氧预处理(HP)后BMSCs对大鼠急性缺血性肾损伤的治疗作用及其可能机制。方法：夹闭双侧肾蒂40min建立大鼠缺血再灌注(Ischemia repeffusion, I/R)急性肾损伤模型。I/R大鼠分为3组：细胞培养基移植组(control组)、常氧培养BMSCs移植组(normoxia+BMSCs组)及HP处理BMSCs移植组(Co+BMSCs组)。移植时机为再灌注后即刻(1h内),移植方式为颈动脉注射。移植后24h、48h、72h及1周时处死大鼠,留取血清和肾组织,检测血清尿素氮(BUN)和肌酐(SCr),并观察肾脏病理变化。同时,以超顺磁氧化铁纳米颗粒(SPION)体外标记大鼠BMSCs,在移植后2h、24h、48h及72h时应用3.0T临床型磁共振仪T2*WI对标记细胞移植大鼠肾脏成像,利用肾脏皮质信号强度变化(ASI)对移植细胞进行活体示踪,比较常氧培养BMSCs和HP处理后BMSCs移植后向肾脏归巢的数量差异。结果：1SPION终浓度为30μg/ml时标记率可达到97.5%±3.2%,普鲁士蓝铁染色显示蓝色铁颗粒位于细胞质内,且细胞生长和活力未受影响。2.再灌注后24h,normoxia+BMSCs组及Co+BMSCs组BUN、Scr水平均低于Control组(P值均<0.05),且Co+BMSCs组低于riormoxia+BMSCs组(P<0.05),再灌注后1周,Co+BMSCs组BUN、Scr水平仍低于normoxia+BMSCs组和control组(P值均<0.05),而后两组之间差异无统计学意义(P>0.05)；再灌注后24h,肾小管上皮细胞损伤以control组最重,normoxia+BMSCs组次之,Co+BMSCs组损伤最轻；再灌注后48h, Co+BMSCs组肾小管上皮细胞修复最明显,且在再灌注后1周Co+BMSCs组未出现明显肾小管上皮细胞萎缩等慢性化改变。3.MR扫描显示,移植前I/R大鼠肾脏皮质信号增强,细胞移植的两组肾脏皮质SI在移植后2h下降最明显,且Co+BMSCs移植组肾脏皮质SI下降更明显(P<0.05),而肾脏髓质及肾盂SI无明显变化；至移植后72h, normoxia+BMSCs组肾脏皮质△SI趋于0,而Co+BMSCs组肾皮质SI仍有明显下降。结论：1.SPION标记BMSCs安全、有效。2.与常氧培养BMSCs移植相比,低氧预处理BMSCs移植能更有效的改善I/R大鼠肾功能、修复肾脏损伤。3.低氧预处理可促进BMSCs向受损肾脏迁移归巢、延长细胞在肾脏内的定植时间。