猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）感染引起猪的一种烈性传染病,具有急性、热性、高度接触性等特点。CSF强毒株感染引起猪高热、出血及器官坏死等临床症状,给养猪业造成巨大的经济损失,而温和型CSF引起猪的免疫抑制,也给养殖场的防疫带来巨大挑战。近年来,随着对CSFV致病机制研究的不断深入,表明CSFV可通过抑制宿主细胞干扰素的产生和细胞凋亡,实现对亲嗜性细胞的持续感染。然而,CSFV致病及引起机体免疫功能紊乱的机制仍不完全清楚。因此,研究CSFV致病及免疫逃逸机制,对CSF的防控具有十分重要的意义。乳酸脱氢酶B（Lactate dehydrogenase B,LDHB）是糖酵解代谢过程中的关键调控酶,能通过影响自噬囊泡的成熟调控自噬的发生。自噬是真核细胞中的大分子物质被包被、吞噬后,转运至溶酶体中降解的过程,可分为非选择性自噬和选择性自噬。自噬受体是介导选择性自噬发生的关键启动因子,能精密调控自噬底物的识别、转运和降解。前期研究表明,CSFV感染诱导细胞自噬并利用自噬促进自身病毒复制。在此基础上,本论文一方面研究了LDHB通过线粒体自噬激活NF-κB信号通路和影响CSFV复制的机制;另一方面研究了自噬受体NDP52在CSFV感染中的作用机制,为CSFV的致病和免疫逃逸机制提供新的理论基础。LDHB基因功能沉默通过线粒体自噬激活NF-κB信号通路和影响CSFV复制的机制研究。前期研究表明CSFV感染重塑糖酵解代谢进程,为探索LDHB在该过程中的作用,本研究用CSFV感染西藏小型猪和PK-15细胞,检测猪血清和细胞培养液中乳酸和丙酮酸含量,结果发现CSFV感染促进乳酸释放但降低丙酮酸含量。但在LDHB基因功能沉默的PK-15细胞中,CSFV对丙酮酸的抑制作用消失,提示LDHB参与CSFV对乳酸和丙酮酸的调控。为研究LDHB与CSFV相互作用关系,我们利用酵母双杂交系统、GST-Pull down、免疫共沉淀技术和激光共聚焦技术,验证了CSFV复制蛋白NS3与LDHB蛋白存在相互作用。进一步利用q RT-PCR和免疫组化技术检测CSFV感染猪肝脏、肾脏、脾脏和扁桃体等器官中LDHB的表达,结果发现CSFV感染显著降低上述器官内LDHB的表达,而且CSFV感染PK-15和3D4/2细胞同样抑制LDHB的表达。上述研究初步明确了LDHB和CSFV感染的关系。研究表明肿瘤细胞线粒体代谢与糖酵解代谢关系密切,而且LDHB定位于线粒体外膜上。为研究LDHB与线粒体自噬的关系,用LDHB特异性干扰RNA对PK-15和3D4/2细胞中的LDHB进行基因功能沉默,并利用透射电镜技术观察线粒体形态;Western blot技术检测线粒体外膜蛋白TOM20、VDAC-1的表达和Mfn2蛋白泛素化;激光共聚焦观察Mito-Tracker、GFP-LC3和CD63三者的共定位及Mito-GFP-RFP双荧光报告系统以检测线粒体的溶酶体递呈情况。结果发现LDHB基因功能沉默后细胞内出现大量膜状结构包裹的线粒体,而且线粒体长度变短;线粒体外膜蛋白TOM20、VDAC-1等的表达均降低,而且Mfn2蛋白泛素化升高;激光共聚焦显微镜发现LDHB基因功能沉默后线粒体丝状结构消失,融合增多,细胞内呈现更多RFP荧光,而且Mito-Tracker、GFP-LC3和CD63三者的共定位增加。以上结果表明LDHB基因功能沉默诱导细胞完整线粒体自噬的发生。为研究LDHB基因功能沉默诱导的线粒体自噬对先天性免疫的影响,我们首先检测LDHB对NF-k B信号通路和细胞因子的影响。通过双荧光素酶实验,发现LDHB基因功能沉默能够激活NF-κB和IFNβ信号通路,过表达LDHB则相反。用Western blot检测LDHB基因功能沉默细胞中NF-κB信号通路相关蛋白P65、IκB-A、p-IκB-A、IκB-Ras-2等的表达发现,LDHB基因功能沉默促进NF-κB信号通路相关蛋白的表达;而CSFV感染LDHB基因功能沉默的细胞后,能够降低NF-κB信号通路相关蛋白表达水平,说明CSFV感染减弱LDHB对NF-κB信号通路的作用。而且LDHB基因功能沉默明显增强IFNα、IFNβ和TNF细胞因子的转录和释放水平,但CSFV感染抑制上述细胞因子的释放而利于自身病毒的复制。为了验证LDHB是否通过线粒体自噬作用于NF-κB信号通路的激活,选取线粒体自噬干扰质粒sh Parkin或线粒体自噬激活剂CCCP处理PK-15和3D4/2细胞,并转染LDHB特异性干扰RNA,结果发现,CCCP促进NF-κB信号通路相关蛋白的表达,而且与LDHB特异性干扰RNA具有协同促进IκB-A等蛋白表达的作用,而sh Parkin作用则相反,说明LDHB通过线粒体自噬作用于NF-κB信号通路的激活。进一步研究发现CCCP诱导的线粒体自噬抑制细胞因子的产生,而sh Parkin干扰质粒则促进细胞因子的产生。为研究LDHB是否通过线粒体自噬或NF-κB信号通路影响CSFV的复制,我们首先检测LDHB对CSFV复制的影响。通过检测LDHB基因功能沉默和过表达细胞中CSFV Npro蛋白的表达、病毒滴度和病毒基因拷贝,结果发现LDHB基因功能沉默促进CSFV Npro蛋白的表达、CSFV m RNA拷贝数和病毒滴度,而过表达LDHB则相反,说明LDHB基因功能沉默具有促进CSFV复制的作用,而过表达LDHB则抑制CSFV复制。为进一步研究LDHB基因功能沉默影响CSFV复制的机制,用线粒体自噬激活剂CCCP、线粒体自噬干扰质粒sh Parkin和NF-κB信号通路抑制剂BAY处理PK-15和3D4/2细胞,然后转染LDHB特异性干扰RNA,并在转染24 h后以MOI=1的CSFV感染细胞,用Western blot检测LDHB和Npro蛋白的表达或q RT-PCR检测CSFV NS5B m RNA的相对表达,结果发现CCCP能够协同LDHB干扰RNA促进CSFV Npro蛋白的表达和NS5B m RNA的相对表达,但sh Parkin则拮抗LDHB干扰RNA对CSFV Npro的表达,BAY对CSFV Npro蛋白的表达和NS5B m RNA相对表达的作用不明显,表明LDHB基因功能沉默通过线粒体自噬作用于CSFV的复制。研究表明CSFV感染抑制细胞凋亡而促进自身复制。为研究LDHB对细胞凋亡的影响,用Western blot检测LDHB基因功能沉默的PK-15和3D4/2细胞中cleaved-PARP、cleaved-caspase-3,cleaved-caspase-9等凋亡相关分子表达。结果发现,LDHB基因功能沉默可减少细胞凋亡蛋白的表达,在CSFV感染细胞中这种减少作用更加明显。另外,采用Annexin V-FITC和PI标记凋亡细胞并用流式细胞术检测双阳性凋亡细胞的比例,发现LDHB基因功能沉默减少CSFV感染细胞中的双阳性凋亡细胞比例;而过表达LDHB则能增加CSFV感染细胞双阳性凋亡细胞比例,提示LDHB可能通过减少细胞的凋亡来促进CSFV的复制。NDP52在CSFV感染中的作用及机制研究。NDP52作为自噬受体蛋白在病原微生物感染中发挥重要作用。前期研究发现CSFV以自噬囊泡作为自身复制的场所,但CSFV进入自噬囊泡的机制尚不清楚。为了研究NDP52与CSFV的相互作用关系,我们检测CSFV感染PK-15细胞后NDP52的表达和蛋白修饰水平。结果发现,CSFV感染抑制PK-15细胞中NDP52的转录和蛋白表达及NDP52蛋白泛素化和SUMO2-4化修饰。自噬受体蛋白泛素化修饰与PINK1-Parkin通路密切相关,为验证CSFV是否通过PINK1-Parkin途径影响NDP52蛋白修饰,我们检测CSFV感染对Parkin蛋白的影响,结果发现CSFV感染促进了Parkin蛋白的表达和泛素化。进一步用CSFV感染Parkin基因功能沉默的PK-15细胞,发现抑制PINK1-Parkin途径上调NDP52蛋白的修饰表达,说明CSFV通过PINK1-Parkin途径调控NDP52的蛋白修饰。为了研究NDP52对CSFV复制的作用,用特异性干扰RNA抑制NDP52在PK-15细胞的表达后感染CSFV,发现CSFV的病毒滴度和CSFV m RNA拷贝数降低,病毒蛋白Npro表达下降,说明NDP52促进CSFV的复制。自噬受体介导选择性自噬的发生。为了研究NDP52对自噬的影响,利用激光共聚焦观察NDP52基因功能沉默的PK-15细胞中GFP-LC3和GFP-RFP-LC3自噬双荧光报告中荧光强度变化;利用Western blot对自噬标志分子进行检测发现。结果发现GFP-LC3荧光强度减弱;GFP-RFP-LC3自噬双荧光中GFP荧光比例增多;LC3、Becn I等自噬蛋白的表达减少,而TOM20、VDAC-1表达增多。上述结果表明,NDP52基因功能沉默可抑制自噬的发生。前期研究发现,CD63作为溶酶体的标志分子能够和CSFV的E2蛋白相互作用。我们用CSFV感染NDP52基因功能沉默的PK-15细胞,Western blot检测结果发现CD63蛋白表达降低;激光共聚焦检测发现CD63与E2蛋白、Parkin分子与E2蛋白在细胞质内的结合均减少,提示NDP52能诱导CD63与CSFV E2的结合来促进病毒进入自噬囊泡,从而有利于CSFV的复制。进一步研究发现,NDP52基因功能沉默激活NF-κB信号通路及细胞因子的释放。综上所述,我们发现LDHB基因功能沉默后能够通过线粒体自噬激活NF-κB信号和促进CSFV的复制,NDP52基因功能沉默影响CSFV E2蛋白和CD63和Parkin分子的结合而且降低CSFV的复制水平。