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急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)是造血组织的恶性疾病,约占急性髓细胞性白血病(acute myeloid leukemia,AML)的10%-15%。PML-RARα融合蛋白一直被认为是导致APL发病的主要负性因素。作为一种经典的诱导分化剂,全反式维甲酸(all-trans retinoic acid;ATRA)已经广泛地应用于APL的临床治疗,并且与三氧化二砷(arsenic trioxide;As2O3)被公认为是肿瘤靶向治疗最成功的范例。它们可以直接与APL中PML-RARα融合蛋白相互作用,通过泛素化蛋白酶水解途径或自噬依赖的途径降解致癌蛋白,或者通过抑制m TOR激酶激活自噬从而降解PML-RARα,而自噬水平的升高可以促进APL细胞的分化。然而,ATRA的临床应用仍存在维甲酸综合征及耐药等不足。4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯(4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate,ATPR)是本课题组以ATRA为先导化合物设计及合成的一种新型维甲酸衍生物。前期研究结果已经证实ATPR可以在体内及体外诱导APL细胞的分化,但其具体作用机制仍不清楚。为了深入地研究ATPR诱导APL细胞分化潜在的分子机制及自噬在ATPR诱导APL细胞分化过程中的作用。本研究选用NB4细胞株为实验对象,体外观察ATPR对NB4细胞自噬的影响以及自噬在ATPR诱导NB4细胞分化中的作用。本文的主要研究内容包括以下三个部分:1.ATPR对NB4细胞自噬表达的影响NB4细胞经不同梯度浓度(0、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 M;48h)的、不同时间点(0、24、48、72h;10-6 M)的ATPR刺激,采用Western Blot技术检测自噬相关蛋白LC3B-II、Beclin1的表达变化;实时荧光定量PCR技术检测自噬相关基因ATG5、Beclin1的表达变化;单丹磺酰尸胺(MDC)染色、mcherry-EGFP-LC3B荧光质粒转染及透射电镜技术观察ATPR(10-6M)作用48h后NB4细胞中自噬小体及酸性自噬溶酶体的变化情况。结果显示:ATPR体外用药可诱导NB4细胞自噬,10-6M药物作用48h后自噬水平升高较为显著,自噬相关蛋白LC3B-II及Beclin1的表达量升高;ATG5及Beclin1的m RNA表达量增加;细胞中自噬小体及酸性自噬溶酶体的数量增加。2.自噬对ATPR诱导NB4细胞分化的影响NB4细胞经3-MA(5m M)预处理1h后,再给予ATPR(10-6M)作用48h,运用Western Blot技术检测自噬相关蛋白LC3B-II、Beclin1的表达变化以及PML-RARα融合蛋白的表达情况;瑞氏吉姆萨染色检测NB4细胞形态学的变化;流式细胞仪检测NB4细胞表面分化抗原CD11b的表达情况以及细胞周期分布情况。结果显示:3-MA作用后,ATPR诱导的自噬相关蛋白LC3B-II、Beclin1的表达以及PML-RARα融合蛋白的降解水平下调,NB4细胞向正常细胞分化的形态学改变也受到抑制,阻断自噬也降低了ATPR诱导的CD11b的表达以及细胞周期阻滞在G0/G1期的现象。为了进一步探究自噬对ATPR诱导NB4细胞分化的影响。我们应用ATG5-siRNA预处理NB4细胞6h后,再给予ATPR(10-6M)作用48h,运用Western Blot技术检测ATG5、LC3B-II、PML-RARα的蛋白表达情况;运用瑞氏吉姆萨染色及流式细胞仪检测NB4细胞形态学变化和细胞表面分化抗原CD11b的变化情况。结果显示:沉默ATG5可以抑制ATPR诱导的NB4细胞LC3B-II、Beclin1的表达以及PML-RARα融合蛋白的降解水平,同时沉默ATG5也可以抑制ATPR诱导的NB4细胞向成熟细胞分化的形态学改变和细胞表面分化抗原CD11b的表达。3.Notch1/Hes1信号通路在ATPR诱导NB4细胞自噬及分化中的作用NB4细胞经ATPR(10-6M)作用48h后,运用Western Blot技术检测Notch1和Hes1蛋白的表达情况。结果显示:ATPR(10-6M)作用48h可显著上调Notch1和Hes1的蛋白表达水平。为进一步探究Notch1/Hes1信号通路发挥的作用,我们应用γ-分泌酶抑制剂DAPT(10μM)预处理NB4细胞1h后,再给予ATPR(10-6M)作用48h,运用Western Blot技术检测Notch1、LC3B-II、PML-RARα蛋白的变化情况;运用单丹磺酰尸胺(MDC)染色和瑞氏吉姆萨染色观察NB4细胞中酸性自噬溶酶体的变化情况和细胞形态学变化;运用流式细胞仪检测NB4细胞表面分化抗原CD11b的表达以及细胞周期变化情况。结果显示:DAPT预处理后,显著降低了ATPR诱导的Notch1、LC3B-II的蛋白表达及PML-RARα的降解水平,NB4细胞中酸性自噬溶酶体的数量降低,同时细胞形态学改变也受到抑制,CD11b表达下调,细胞周期阻滞在G0/G1期受到抑制。