研究背景子宫内膜癌是导致女性绝经后阴道出血的常见妇科恶性肿瘤之一,近年来其发病率有上升趋势。随着分子生物学技术的不断发展,基因分型与靶向药物成为诊断和治疗子宫内膜癌的新方法、新手段。因而深入研究子宫内膜癌发生发展过程中的基因改变和蛋白调控,对临床诊断和治疗具有指导意义。众所周知,癌细胞相比正常细胞增殖更为活跃,而细胞的分裂和增殖过程需要合成大量的蛋白质,因此,作为合成蛋白质的重要工具,核糖体在核仁中的生成也随之增加,并造成肿瘤细胞核仁肥大。子宫内膜癌的生长和肿瘤体积的增大,也离不开癌细胞的快速增殖以及蛋白质与核糖体的合成。但不同于一般恶性肿瘤,子宫内膜癌细胞核仁大小与良性病变表现差别不大。为解释这一现象,有研究者应用核仁蛋白质组学检测发现核仁具有动态、复杂的蛋白质组,核糖体蛋白和核仁蛋白是组成核仁最主要的蛋白质,而核仁蛋白可能在子宫内膜癌中发挥了重要作用。核仁蛋白除参与核糖体生成以外,还可以通过调控相关蛋白的表达参与肿瘤细胞的增殖。核仁蛋白在多种恶性肿瘤中表达升高,并发挥促进癌症进展和转移的作用。核仁蛋白6（Nucleolarprotein6,NOL6）是一种核仁RNA相关蛋白,参与核糖体的生物发生,并与阿尔兹海默病等非癌症疾病有关,但NOL6在癌症中的作用和功能尚未阐明。有研究发现,NOL6基因突变可以导致由p53调节的基因转录水平增加,而p53是子宫内膜癌分子分型诊断的常用生物标志物之一。结合现有结论,我们猜测NOL6可能具有调节子宫内膜癌相关蛋白表达的功能,进而影响子宫内膜癌的发生和发展。因此,本研究主要验证了 NOL6在子宫内膜癌中的功能,初步探索了其可能的作用机制,为子宫内膜癌中NOL6分子改变的潜在临床应用奠定理论基础。第一部分:NOL6在子宫内膜癌中的表达和功能研究研究目的1.通过比较NOL6在正常和癌性子宫内膜组织中的表达,分析NOL6是否与子宫内膜癌的发生相关。2.通过细胞功能学实验研究NOL6对子宫内膜癌细胞增殖、迁移、凋亡的影响。3.通过体内实验研究NOL6对子宫内膜肿瘤形成的作用。研究方法1.利用免疫组织化学染色,分析NOL6蛋白在子宫内膜组织中的表达变化。2.使用慢病毒转染,在细胞中合成干扰RNA片段,减少目的基因NOL6的蛋白合成,通过标记性荧光蛋白表达、RT-qPCR和Western blot检测慢病毒转染细胞中NOL6的mRNA和蛋白表达情况。3.采用细胞计数法、MTT法和克隆形成法分析细胞增殖能力的变化。4.采用流式细胞术检测细胞凋亡。5.使用Transwell迁移实验和划痕愈合试验,评估细胞迁移能力的改变。6.利用肿瘤异种移植,分析NOL6对体内肿瘤形成过程的影响。研究结果1.相比于正常子宫内膜组织,NOL6在子宫内膜癌中表达升高。2.NOL6在子宫内膜癌细胞增殖过程中发挥重要作用,敲减NOL6表达后子宫内膜癌细胞的增殖能力减弱。3.NOL6可以减少子宫内膜癌细胞的凋亡率。4.NOL6可以促进子宫内膜癌细胞的迁移能力。5.NOL6有利于子宫内膜癌细胞在体内形成肿瘤,抑制NOL6表达可以减小肿瘤形成的大小、减慢肿瘤生长速率。研究结论对照正常子宫内膜,NOL6在子宫内膜癌中的表达上调。体外实验显示,NOL6对子宫内膜癌细胞的增殖和迁移具有正向促进作用,同时帮助抑制子宫内膜癌细胞的凋亡。体内实验证明NOL6有利于子宫内膜肿瘤的生长。第二部分:NOL6在子宫内膜癌中的作用机制研究研究目的1.研究子宫内膜癌细胞中受NOL6表达水平影响的下游蛋白分子。2.探索NOL6调控子宫内膜癌细胞增殖和迁移的分子机制。研究方法1.通过Western blot检测在不同NOL6表达水平下,子宫内膜癌HEC1A细胞中肿瘤相关信号通路蛋白的表达变化,并筛选出可能影响细胞功能的蛋白进行下游实验。2.利用慢病毒转染反向恢复受NOL6表达水平影响较大的MYC、Twist1和MMP2在HEC1A Ri-NOL6细胞中的表达水平,利用标记性荧光蛋白确认病毒转染的效率。3.使用细胞计数法观察MYC、Twist1和MMP2对敲减NOL6表达后的HEC1A细胞增殖能力的影响,筛选可以恢复HEC1A细胞增殖能力的基因。4.通过MTT实验对Twist1在敲减NOL6表达后的HEC1A细胞增殖中的作用再次验证。5.利用Transwell细胞迁移实验,观察Twist1对敲减NOL6表达后的HEC1A细胞迁移能力的影响。6.Western blot检测敲降NOL6的HEC1A细胞在恢复Twist1表达后的相关蛋白表达变化。7.利用免疫荧光验证人子宫内膜组织中的NOL6和Twist1蛋白表达,探索NOL6在细胞中发挥作用的可能机制。研究结果1.HEC1A细胞中有多种蛋白与NOL6的表达相关。在敲降NOL6表达后,p-NFκB表达上调,而 Twist1,c-Myc,p-AKT,Fibronectin,Snail,p-β-Catenin,mTOR,p-ERK,MMP-2,N-Cadherin 和 MMP9 的表达下调。其中,MYC、Twist1 和 MMP2 在 NOL6 基因敲降后表达下调最明显。2.在敲减NOL6后的HEC1A细胞中过表达MYC、Twist1和MMP2,结果显示过表达MYC后的Ri-NOL6细胞的增殖能力没有得到恢复,过表达Twist1的细胞增殖能力恢复较明显,而过表达MMP2的细胞增殖能力略有提升,但效果不明显。3.MTT实验显示提高敲减NOL6的HEC1A细胞中的Twist1表达可以使细胞增殖能力得到一定程度的恢复。4.Transwell细胞迁移实验表明过表达Twist1可以恢复敲减NOL6后HEC1A细胞受损的迁移能力。5.相比于正常子宫内膜,在子宫内膜癌组织中NOL6和Twist1的表达均升高。6.在NOL6低表达的裸鼠肿瘤组织中,Twist1的表达也降低,这表明NOL6和Twist1的表达具有相关性。研究结论NOL6能够影响子宫内膜癌细胞中多种与癌症相关的蛋白表达,其中Twist1受NOL6的调控,NOL6通过调节Twist1的表达影响子宫内膜癌细胞的增殖和迁移,二者在子宫内膜癌发病过程中发挥协同作用。