溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）是一种常见的消化系统疾病,其主要特征是血便、腹痛和体重减轻,患者常伴有焦虑抑郁等精神症状,而其病因至今仍不清楚。有研究发现,在UC患者循环系统中发现了升高的2型免疫细胞因子（如IL-13）,表明2型免疫是参与UC发病的重要因素。临床上治疗UC有多种药物选择,但是多数存在明显的毒副作用,并且单抗类药物并不适用于所有患者,目前寻找安全有效的治疗手段仍为大势所趋。早期研究认为仅有松果体分泌褪黑素（N-acetyl-5-methoxytryptamine,Melatonin,MT）,而随后的研究发现褪黑素在肠道内富集,在肠道局部的褪黑素浓度是循环系统褪黑素浓度的100-400倍且受饮食节律调节。肠道褪黑素由肠嗜铬细胞（EC）主要分泌（超过90%）,且肝脏清除效率高,仅在局部发挥生理作用。在UC中,循环系统中褪黑素的浓度降低,同时EC的功能发生显著变化,由于肠道位于UC的发病部位,受UC的影响更加直接,所以探索肠道局部的褪黑素含量与UC的相关性具有临床意义。由于UC病因复杂,病因明确的实验性结肠炎小鼠是目前研究UC的主要手段。实验性结肠炎的诱导剂分别是葡聚糖硫酸钠盐（DSS）、三硝基苯磺酸（TNBS）和恶唑酮（Oxazolone）。褪黑素可以缓解DSS和TNBS诱导的实验性结肠炎,其作用机制包括:抑制氧化应激;改善肠道细胞的活性氧耐受;作用于褪黑素受体并通过特定的信号通路（如TLR4通路）调控免疫细胞活性。近年来,2型免疫在UC进程中的重要作用逐渐引起了研究者们的关注,且已有针对2型免疫的药物进入了临床实验。恶唑酮诱导的结肠炎是在这3种模型中,唯一由2型免疫介导的,对应了临床上UC患者的2型免疫增强的现象,因此恶唑酮是研究褪黑素对2型免疫介导结肠炎的理想模型。目前褪黑素对于恶唑酮诱导实验性结肠炎的影响及其作用机制仍然未知。第一部分:褪黑素在溃疡性结肠炎中作用的研究研究目的:本研究的目的在于探索肠组织中的褪黑素在UC中的作用,并探究褪黑素对于小鼠恶唑酮介导结肠炎的影响。研究方法:临床研究:根据UC的诊断标准纳入UC患者11例,健康对照者17例,UC患者在结肠镜下采集降结肠到乙状结肠的溃疡病变部位活检粘膜,健康对照对应UC取样部位随机采集。得到的组织使用酶联免疫标记法（Enzyme-linked immunoabsorbent assay,ELISA）检测肠组织中褪黑素的表达水平,并将其与结肠炎的病理评分进行相关性分析。使用实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR）检测肠组织中合成褪黑素的关键酶AANAT和HIOMT的表达。基础研究:使用恶唑酮诱导小鼠2型免疫介导的实验性结肠炎并使用褪黑素干预,使用Western Blot、qPCR和流式细胞术等手段评估对照组（无褪黑素干预）和实验组（褪黑素干预）小鼠的结肠炎严重程度。研究结果:实验发现,UC患者的肠道褪黑素浓度显著降低（p＜0.0001）。且随着UC病理评分的增加,褪黑素的组织浓度逐渐降低,二者呈显著的负相关（r=-0.7481,p=0.0013）,qPCR显示在UC患者中,褪黑素合成关键酶AANAT和HIOMT的mRNA表达量显著低于健康对照（p＜0.001）。褪黑素干预可以使恶唑酮诱导的实验性结肠炎小鼠体重下降减轻（p＜0.001）,结肠缩短程度降低（p＜0.01）,病理评分下降（p＜0.001）,中性粒细胞浸润减少（p＜0.001）,炎症细胞因子TNFα和IL-lβ降低（p＜0.05）,紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达量增加（p＜0.001）。研究结论:（1）结肠组织中的褪黑素与UC的病理评分呈显著负相关。（2）UC患者肠道褪黑素的合成功能显著下降。（3）褪黑素干预可以明显缓解小鼠中2型免疫介导的实验性结肠炎。第二部分:褪黑素缓解小鼠2型免疫介导的实验性结肠炎机制的研究研究目的:在此部分中,本研究结合褪黑素与恶唑酮诱导的实验性结肠炎,在机制部分展开详细讨论,聚焦并探索免疫机制和微生物机制。在弥补领域内空白的同时,期望指导临床用药,为UC患者提供新的选择。研究方法:免疫机制的探索:确定响应恶唑酮的小鼠免疫组分,随后使用流式细胞分析和qPCR等技术检测对照组（褪黑素不干预）和实验组（褪黑素干预）小鼠体内2型免疫致炎因子IL-5和IL-13的变化;使用流式细胞分选该类细胞,在体外使用褪黑素刺激并检测其功能变化。微生物机制的探索:对比分笼饲养和同笼饲养方式下小鼠恶唑酮造模后的肠道炎症严重程度相关的各项指标;使用粪便菌群16 S测序等手段分析褪黑素对肠道菌群造成的影响,并在属水平上具体分析特定微生物的变化;使用粪便菌群移植的手段检测褪黑素干预后小鼠菌群是否可以独立缓解恶唑酮诱导的实验性结肠炎。研究结果:经过流式检测,在小鼠恶唑酮诱导的实验性结肠炎中,2型固有免疫细胞（ILC2）是引起炎症的主要细胞类群。褪黑素可以显著抑制结肠炎小鼠中ILC2产生的致炎细胞因子IL-13（p＜0.01）,且肠道组织中IL-5和IL-13的mRNA表达显著降低（p＜0.05）。在体外,褪黑素可以时间和剂量依赖地抑制肠道固有层淋巴细胞中ILC2分泌IL-5和IL-13。当小鼠同笼饲养后,褪黑素缓解小鼠结肠炎的效果消失,在小鼠体重、结肠长度、肠道病理、免疫细胞浸润、炎性因子分泌和紧密连接蛋白表达等方面均无显著性差异（p＞0.05）。小鼠粪便菌群测序发现,在OTU水平上褪黑素可以显著改变小鼠的肠道菌群的α多样性和β多样性,并在属水平上改变肠道菌群的组成。最后,通过菌群移植实验证实经过褪黑素干预的肠道菌群可以缓解恶唑酮诱导的实验性结肠炎。研究结论:（1）褪黑素抑制小鼠ILC2细胞分泌2型细胞因子。（2）褪黑素可以调节小鼠体内肠道菌群,使有益菌增加,机会性致病菌减少。（3）褪黑素缓解恶唑酮诱导的实验性结肠炎是依赖于肠道菌群的改变。（4）移植褪黑素处理的肠道菌群可以缓解恶唑酮诱导的实验性结肠炎。