研究背景肺癌是全球癌症死亡的主要原因之一,中国2022年估计将有77万人死于肺癌。由于目前的诊断局限性和临床耐药性,肺癌患者5年生存率仅为15-20%。非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer,NSCLC）是源于支气管粘膜上皮或肺泡上皮的恶性肿瘤,是一种最常见的肺癌类型。近年来随着医学技术的发展,包括靶向治疗和免疫疗法在内的新的治疗手段已经给部分患者带来了前所未有的生存获益,但NSCLC的总体治愈率和存活率仍然很低,特别是晚期肺癌患者。因此,需要新的药物或者联合治疗策略来改善NSCLC的预后。表观遗传修饰是不改变DNA序列而调控基因表达的过程。越来越多的证据表明,表观遗传修饰酶失调与癌症的发生和发展有关,针对表观基因组相关的分子治疗可以改善癌症症状。SETD1A（SET domain containing 1A）是一种表观遗传修饰酶,是含有SET结构域的组蛋白赖氨酸甲基转移酶,主要表达于细胞核内,分布于全身多个组织。它不仅参与组蛋白修饰,还在DNA损伤修复、细胞周期、基因转录、基因组印记及肿瘤发生发展过程中都具有重要的调控作用。H3K4me3（Histone 3 lysine 4 trimethylation）是组蛋白 3 第 4 位赖氨酸的三甲基化,它富集在转录起始位点附近的启动子上,作为一个组蛋白密码来识别基因启动子,通过共价修饰、染色质重塑等方式激活癌基因转录,参与多种恶性肿瘤的发展进程和预后。研究证实H3K4me3水平在肺腺癌细胞系中升高,并参与了异常的转录调控,然而其机制不清楚。SETD1A通过SET结构域结合组蛋白H3K4修饰位点,可以特异性催化组蛋白H3K4位点三甲基化（H3K4me3）,H3K4me3与激活基因的促进区和早期的转录区域有关,可释放转录延伸,导致基因转录水平发生变化。SETD1A使H3K4me3修饰水平表达升高,并诱导基因活化,参与多种恶性肿瘤的发生与发展。研究发现SETD1A在肺癌中表达明显升高,可促进肺癌细胞的增殖,且与肺癌患者的生存预后相关,然而,SETD1A在NSCLC中的生物学作用及机制在很大程度上仍不清楚。在本研究中,通过生物信息学分析及临床肺腺癌组织明确SETD1A在NSCLC组织中的表达情况及与临床预后的关系,并且通过体内外实验研究SETD1A差异表达对NSCLC细胞增殖、侵袭和迁移的影响,初步探讨了SETD1A参与NSCLC进展的分子机制。本研究阐明了 SETD1A在NSCLC中的作用及发生机制,可能为NSCLC的治疗提供新的分子靶点。研究目的通过生物信息学及临床NSCLC组织的分析,明确SETD1A在NSCLC组织中的表达情况及与临床预后的关系,通过体内外实验探讨SETD1A差异表达对NSCLC细胞增殖、侵袭与转移的影响及可能的分子机制。研究方法1.生物信息学及临床NSCLC组织分析:（1）通过TCGA数据库检索SETD1A mRNA在NSCLC组织和癌旁组织中的表达,及其与肺癌患者生存期、临床TNM分期的关系;（2）GEO数据库检索组蛋白甲基化酶在肺癌组织和癌旁组织中的表达;（3）收集临床肺腺癌患者标本,通过免疫组化检测SETD1A蛋白在肺腺癌组织及癌旁组织中的表达情况,并分析SETD1A蛋白与患者临床病理参数之间的相关性。2.体外实验:（1）应用RT-qPCR筛选出SETD1A表达量相对较高的A549和H1299细胞进行功能分析;（2）用慢病毒包装SETD1A shRNA构建SETD1A敲降A549/H1299稳转细胞系,运用Western blot验证敲降效率;（3）通过台盼蓝染色计数细胞,观察SETD1A对NSCLC细胞增殖能力的影响,通过Western blot实验检测SETD1A对细胞增殖相关蛋白表达的影响;（4）通过细胞划痕实验及Transwell小室实验检测SETD1A对肺癌细胞迁移和侵袭的影响;（5）通过Western blot实验检测SETD1A对A549及H1299细胞EMT相关标记物蛋白表达的影响;（6）免疫荧光实验检测SETD1A对A549细胞中整体H3K4me3的影响,CHIP实验检测SETD1A对特定原癌基因启动子区H3K4me3甲基化修饰的影响,Western blot检测被转录调控改变的原癌基因的蛋白水平。3.体内实验:（1）于裸鼠背部皮下注射慢病毒转染的A549/H1299细胞,成功构建裸鼠移植瘤模型;（2）测量敲降SETD1A对裸鼠移植瘤大小和重量方面的影响;（3）通过RT-qPCR检测SETD1A对裸鼠移植瘤EMT相关标记物的影响;（4）通过RT-qPCR检测SETD1A对裸鼠移植瘤原癌基因的影响。结果1.生物信息学及临床NSCLC组织分析:（1）SETD1A在NSCLC中频繁发生扩增、突变,与部分缺失或二倍体相比,SETD1A基因位点的扩增、突变上调了 SETD1A在NSCLC中的转录水平。（2）与癌旁组织相比,SETD1A mRNA在肺腺癌组织中表达明显增强,且TNM分期越晚,SETD1A mRNA表达水平越高,表明SETD1A与肺腺癌的临床分期呈正相关。（3）Kaplan-Meier生存曲线分析显示,SETD1AmRNA水平与肺癌患者生存期呈高度负相关,此外,与SETD1A甲基化相关蛋白（WDR5和HCFC1）与总体生存状态也呈负相关,这些结果说明SETD1A与NSCLC患者不良预后有关。（4）KMT2家族成员（SETD1A除外）mRNA水平在肺癌组织和癌旁组织中的表达无明显差异,表明SETD1A在肺癌中发挥着独特的KMT组蛋白甲基转移酶的作用,并且可能对肺癌进展中H3K4me3的调控起主要作用。（5）SETD1A蛋白在肺腺癌组织中高表达,主要位于细胞核中,且与临床TNM分期有关。2.体外实验:（1）Western blot结果显示,敲降SETD1A基因抑制NSCLC中SETD1A及Non-P-CTNNB1蛋白表达。（2）与对照组相比,在A549及H1299中敲降SETD1A可以快速且显著地抑制细胞增殖。（3）敲降SETD1A可下调A549及H1299细胞增殖相关蛋白的表达,但ERK信号（P-MAPK1）的蛋白表达下调不明显。（4）划痕实验结果显示在A549细胞中敲降SETD1A基因后抑制细胞迁移能力;Transwell实验也表明在A549及H1299细胞中敲降SETD1A基因后抑制A549和H1299细胞的迁移和侵袭能力。（5）敲降SETD1A基因能上调A549及H1299细胞中上皮细胞标志物CDH1蛋白的表达,可下调间质细胞标志物（CDH2,VIM,ZEB1和SNAIL1）蛋白的表达。（6）免疫荧光显示A549细胞中SETD1A敲降效果明显,但SETD1A敲降并未导致整体H3K4me3信号明显减弱。而CHIP实验发现原癌基因的转录调控区H3K4me3的修饰发生相应的下降,说明原癌基因的转录水平受到一定程度的抑制。Western blot实验发现原癌基因的蛋白表达水平也明显下调。3.体内实验:（1）成功构建NSCLC裸鼠移植瘤模型,与对照组相比,下调SETD1A表达明显抑制NSCLC裸鼠移植瘤的生长速度。（2）敲降SETD1A基因能明显上调NSCLC裸鼠移植瘤中上皮特征标记物mRNA的表达,下调间质细胞标记物mRNA的表达。（3）敲降SETD1A基因可导致NSCLC裸鼠移植瘤表观遗传修饰酶及原癌基因表达水平降低。结论1.SETD1A参与NSCLC的发展进程,且与患者的临床不良预后有关。2.SETD1A调控EMT进程,促进NSCLC细胞的侵袭及迁移能力。3.SETD1A可能通过H3K4me3水平调节NSCLC的多种原癌基因,进而促进NSCLC进展。