论文部分内容阅读
【研究背景】随着社会老龄化,阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)等衰老相关的神经退行性疾病的发病率逐年升高,患者表现为逐渐失去生活自理能力,给家庭和社会带来巨大精神和经济负担。AD以慢性、进行性学习及记忆能力下降为主要临床表现,其发病机制不清是限制临床治疗药物研发的瓶颈。已知小胶质细胞活化失控所致的过度炎症反应是导致神经元慢性退变的重要原因,而最新研究表明胰岛素抵抗是诱发小胶质细胞功能失调的关键因素。从胰岛素抵抗的角度揭示脑内免疫稳态的调控过程,将为AD发病机理研究及抗炎药物研发提供新思路。已知肝脏对机体胰岛素敏感性具有重要调控作用,而脂肪肝的发病与胰岛素抵抗现象的发生关系密切,但其具体调控机制尚不清楚。近期有研究表明mi RNA生成过程的关键调控蛋白-III型RNA酶Drosha可以通过非RNA酶活性/mi RNA依赖的方式调节发育分化、细胞存活和炎症应答等系列生理过程,但尚不清楚Drosha功能异常是否参与脂肪肝和和胰岛素抵抗发生。【研究目的】本研究拟从体外细胞模型及动物模型等多层次展开探索,旨在明确Drosha在脂肪肝和胰岛素抵抗发生中的作用,并揭示Drosha调控肝脏脂质合成的具体机制;在此基础上,进一步证实干预肝脏Drosha-脂质合成调节通路可以改善机体胰岛素抵抗、大脑炎症和神经元退变。本课题拟以Drosha为切入点,阐明“脂肪肝-胰岛素抵抗-脑内炎症”轴在神经元退变中的作用,为AD等神经退行性疾病的防治提供潜在的干预靶点。【方法与结果】1.Drosha以非RNA酶活性依赖的方式调节脂质合成为明确Drosha在细胞脂质合成中的作用,我们分别构建了Drosha和Dicer(mi RNA合成过程中的另一个关键酶)稳定敲减的细胞系,通过油红O染色和非靶向脂质代谢组学分析,我们发现敲减Drosha能明显抑制脂质合成,而敲减Dicer对脂质含量无显著影响;然后,通过q PCR检测脂质合成酶m RNA的表达水平,结果显示,敲减Drosha使脂质合成酶m RNA的含量明显下降,而敲减Dicer对这些基因的表达无显著影响。脂质合成酶的表达主要受转录因子SREBP(sterol-regulated element binding protein)调节。SREBP以无活性的前体形式存在于内质网膜上,受到胰岛素刺激后转移至高尔基体,被蛋白酶切割而释放出有活性的转录结构域。通过免疫印迹实验检测SREBP1蛋白由前体向成熟体的剪切,结果显示敲减Drosha能明显抑制SREBP1的剪切,而敲减Dicer对SREBP1的剪切无明显影响;通过在细胞内表达Drosha RNA酶活性失活性突变体,我们发现Drosha调节SREBP1的剪切不依赖于其RNA酶活性;最后,通过构建Drosha不同结构域缺失的截短体,进一步证实Drosha主要通过N端蛋白结构域,而非C端的RNA酶结构域调控了SREBP1的剪切。以上实验结果提示Drosha以非RNA酶依赖方式调节了SREBP1成熟和脂质合成。2.Drosha促进COPII复合体介导的SREBP1胞内转运已知SREBP1在其伴侣分子SCAP的协助下,从内质网出芽被转运至高尔基体是其被剪切的前提。为进一步明晰Drosha调节SREBP1剪切的具体机制,我们采用免疫荧光染色技术检测敲减Drosha或Dicer对SREBP1/SCAP复合体胞内转运过程的影响,结果显示,敲减Drosha能显著抑制SREBP1/SCAP的转位;而敲减Dicer对该复合体的转位无明显影响。然后,通过内质网分离、免疫荧光共定位和免疫共沉淀等实验方法,我们证实了Drosha可以定位于内质网上,并与SREBP1/SCAP复合体结合。SREBP1/SCAP的胞内转运依赖于COPII(coat protein complex II)复合体介导的囊泡运输过程。为了进一步探究Drosha调控SREBP1/SCAP转运的机制,我们构建了COPII复合体各蛋白组分的过表达载体,通过免疫共沉淀证等方法实了Drosha与COPII复合体外层蛋白Sec31相互结合;然后,通过在细胞中过表达不同截短长度的Drosha蛋白,我们发现Sec31主要与Drosha N端的RS-rich结构域结合。COPII复合体组装的关键步骤是内层Sec23-Sec24异二聚体与外层Sec13-Sec31异二聚体的结合。为了验证Drosha是否可以调节COPII复合体的组装,我们采用免疫共沉淀检测了敲减Drosha或Dicer对Sec31与Sec23结合能力的影响,结果显示,敲减Drosha能显著抑制Sec31与Sec23结合,而敲减Dicer对二者结合能力无明显影响;然后,通过在Drosha敲减的细胞系中回复表达野生型或RNA酶失活型Drosha,我们证实了Drosha以非RNA酶活性依赖的方式促进COPII复合体的组装。以上实验结果表明Drosha通过与SREBP1/SCAP复合体以及Sec31结合而调控COPII介导的SREBP1胞内转运。3.Akt-Drosha-SREBP1信号通路在脂质合成中的调节作用在上述实验结果中,我们观察到在脂质合成信号-胰岛素刺激条件下,Drosha的总蛋白水平及内质网分布并没有显著变化,因此,我们推测胰岛素可能通过调控Drosha的翻译后修饰进而影响其功能。胰岛素主要激活细胞的PI3K/Akt信号通路。为了验证Akt是否可以磷酸化Drosha,我们首先通过进行体外激酶实验、过表达Akt激酶、使用Akt激活剂、小分子抑制剂或特异性的竞争性抑制突变体等一系列实验证实了Akt激酶可以直接磷酸化Drosha;然后,通过免疫共沉淀技术,我们发现Akt可以与Drosha结合,并且胰岛素处理能明显增加二者的结合能力;最后,通过磷酸化位点预测、纯化Drosha不同截短体蛋白和基因定点突变技术,明确了Akt主要磷酸化Drosha N端RS-rich结构的第237位丝氨酸。为了进一步阐释Drosha第237位丝氨酸的磷酸化修饰在脂质合成中的作用,我们在Drosha敲减细胞中分别回复表达野生型或抗磷酸化型Drosha,通过免疫共沉淀、q PCR和油红O染色等实验技术,证实了抑制第237位丝氨酸的磷酸化可以减少Drosha与Sec31的结合,降低COPII复合体的组装效率,阻断SREBP1由前体向成熟体的剪切和下游基因表达,最终抑制细胞的脂质合成。上述实验表明Drosha第237位丝氨酸发生磷酸化是细胞启动脂质合成的重要前提条件,Akt-Drosha-SREBP1通路活化是细胞调控脂质合成的重要分子机制。4.干预肝脏Drosha-脂质合成通路对胰岛素抵抗及神经退变的影响采用高脂饮食小鼠模型,通过免疫印迹、q PCR、油红O和HE染色等技术,我们证实了Akt-Drosha-SREBP1脂质合成调节通路在高脂饮食小鼠肝脏中被明显激活。在此基础上,结合Drosha条件性敲除转基因小鼠,我们进一步验证了抑制该通路对肝脏脂质合成和机体胰岛素敏感性的影响。结果显示,敲除肝脏Drosha可以使SREBP1成熟体水平及下游m RNA水平明显下降,同时,生化分析显示敲除Drosha使肝脏及血清中的胆固醇、甘油三酯和脂肪酸含量减少,葡萄糖耐量试验显示敲除肝脏Drosha可以显著改善高脂饮食小鼠葡萄糖耐量和胰岛素抵抗。机体胰岛素抵抗与脑内炎症活化和神经元退变密切相关。与之一致,我们在高脂饮食小鼠模型中通过q PCR也发现脑组织内炎性分子m RNA水平明显升高。上述实验表明敲除肝脏Drosha可以改善高脂饮食小鼠的胰岛素抵抗状态,为进一步明确敲除肝脏Drosha是否可以改善脑内炎症和神经元退变,我们利用Drosha条件性敲除转基因小鼠,通过小胶质细胞免疫荧光染色和β-半乳糖苷酶染色等方法,发现敲除肝脏Drosha可以抑制高脂饮食小鼠脑内小胶质细胞活化,并延缓神经元衰老。以上结果表明肝脏中Drosha-脂质合成通路过度激活是胰岛素抵抗发生的重要机理,靶向该通路以抑制肝脏脂质累积对胰岛素抵抗、大脑炎症和神经退变具有改善作用。【研究结论】综上,本研究阐明了mi RNA生成关键酶-Drosha的新的非经典功能,即Drosha以非RNA酶活性依赖的方式调控了细胞脂质合成过程。Drosha通过促进COPII介导的SREBP1胞内转运,调节SREBP1的剪切和脂质合成酶的表达;发现蛋白激酶Akt可以直接磷酸化Drosha第237位丝氨酸,建立了Akt-Drosha-SREBP1脂质合成调控通路;初步探讨了该通路对胰岛素抵抗和神经退变的调节作用,为AD等神经退行性疾病的发病机制研究和防治策略建立提供了新的理论基础。