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缺血性脑卒中（Ischemic stroke,IS）是指多种原因引起的脑动脉阻塞,导致局部脑血流中断,梗塞区脑组织发生缺血、缺氧坏死,继而出现神经功能缺损的一类临床综合征。本病在临床具有发病率、致残率、致死率和复发率“四高”的特点,对患者的生命健康造成巨大威胁。神经血管单元（Neurovascular unit,NVU）是脑结构和功能的基本单位,血脑屏障（Blood brain barrier,BBB）、胶质细胞、神经元、平滑肌细胞、周细胞和细胞外基质是其主要组成部分。NVU生理病理改变与IS的发生发展密切相关,基于NVU的整体保护正逐渐成为临床治疗IS的共识。针刺是IS常用的治疗方法,可以有效预防卒中和促进卒中后机体的恢复。课题组前期研究发现,电针通过上调脑组织内神经生长相关蛋白-43（Growth associated protein-43,GAP-43）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）、突触囊泡蛋白（Synaptophysin,SYN）表达、下调勿动蛋白A（Neurite outgrowth inhibitor-A,Nogo-A）表达,促进局灶性脑梗死大鼠神经和运动功能的恢复,对大脑中动脉闭塞模型（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）大鼠NVU具有保护作用,且该作用与激活Wnt/β-catenin信号通路密切相关。为进一步验证电针对IS的治疗作用及可能的相关机制,本研究以前期发现为基础,通过构建体外NVU的糖氧剥夺/复糖复氧（Oxygen-glucose deprivation and reoxygenation,OGD/R）模型,以探究电针血清对体外NVU模型缺糖缺氧损伤的作用及可能的相关机制。拟从微观层面揭示针刺调控NVU治疗IS,为针刺的临床应用提供可靠理论依据。第一部分电针血清对体外NVU模型缺糖缺氧损伤的作用目的:观察电针血清对体外NVU模型OGD/R损伤的作用,验证电针血清对IS的神经保护作用。方法:将SPF级雄性健康成年SD大鼠随机分为对照组、模型组、电针组。模型组采用改良线栓法建立大鼠MCAO模型,电针组在模型组的基础上以“醒脑开窍”针刺法干预。干预结束后,将对照组、电针组大鼠进行腹主动脉取血,离心取上清。分离、培养新生SD大鼠乳鼠的皮质神经元、星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞,免疫细胞化学法鉴定细胞纯度。利用细胞共培养技术和transwell insert构建三细胞共培养的体外NVU模型,ERS-2细胞电阻仪测量模型的跨内皮细胞电阻（Transendothelial electrical resistance,TEER）值。将构建的体外NVU模型随机分为对照组（Control）、电针血清组（Control+Es）、模型组（OGD/R）、模型+电针血清组（OGD/R+Es）。CCK-8测定电针血清体外干预的最适浓度和时间,以及各干预组神经元的存活率;TUNEL染色法检测各组神经元凋亡情况;Western blotting分析各实验组神经元Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达情况。结果:1.TEER值的测量:随着共培养时间的延长,TEER值逐渐趋于稳定。2.电针血清体外干预浓度和干预时间的确定:CCK-8结果显示,5%电针血清干预24h神经元的生存率最大,故以5%电针血清浓度作用24h,作为电针血清体外干预的最适条件。3.电针血清提高OGD/R后神经元的生存率:与对照组比较,模型组神经元生存率显著减小（P＜0.01）。与模型组比较,模型+电针血清组神经元生存率显著增大（P＜0.01）。4.电针血清减少OGD/R后神经元的凋亡:TUNEL染色结果示:与对照组比较,模型组凋亡神经元数量显著增多（P＜0.01）。与模型组比较,模型+电针血清组凋亡神经元数量减少（P＜0.01）。Western blotting结果示:与对照组比较,模型组Bcl-2/Bax值减小、Caspase-3表达增多（均P＜0.01）。与模型组比较,模型+电针血清组Bcl-2/Bax值增大、Caspase-3表达减少（均P＜0.01）。结论:1.体外NVU模型初步构建成功。2.OGD/R处理诱导体外NVU模型神经元的损伤。3.电针血清干预可减轻OGD/R诱导的体外NVU模型损伤。第二部分基于Wnt/β-catenin信号通路观察电针血清对体外NVU模型缺糖缺氧损伤的神经保护作用目的:观察电针血清对体外NVU模型缺糖缺氧损伤的神经保护效应及对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用,进而探讨电针血清发挥神经保护作用的可能机制。方法:将体外NVU模型分为对照组（Control）、模型组（OGD/R）、电针血清组（OGD/R+Es）、抑制剂组（OGD/R+XAV939）、电针血清+抑制剂组（OGD/R+Es+XAV939）。CCK-8检测各实验组神经元的存活率;TUNEL染色检测各实验组神经元的凋亡情况;TEER值测量和辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP）渗透性实验检测BBB的完整性;活性氧（Reactive oxygen species,ROS）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）试剂盒检测各实验组氧化应激水平;RT-q PCR、Western blotting实验分析相关检测指标在基因、蛋白水平的表达情况。结果:1.XAV939对Wnt/β-catenin信号通路抑制作用的验证:与模型组比较,抑制剂组轴蛋白Axin表达增多（P＜0.01）,β-catenin表达减少（P＜0.01）,提示Wnt/β-catenin信号通路被抑制。2.电针血清干预促进体外NVU模型OGD/R后神经元的存活:OGD/R处理后神经元存活率显著降低（P＜0.01）,电针血清干预后神经元存活率显著提高（P＜0.01）,加入抑制剂后神经元存活率显著降低（P＜0.01）。3.电针血清抑制体外NVU模型OGD/R后神经元的凋亡:OGD/R处理后神经元凋亡显著增多,Bcl-2/Bax值显著减小,Caspase-3表达显著增多（均P＜0.01）;电针血清干预可减少神经元凋亡,Bcl-2/Bax值增大,Caspase-3表达减少（均P＜0.01）;抑制剂干预后神经元凋亡显著增多,Bcl-2/Bax值下调,Caspase-3表达上调（均P＜0.01）。4.电针血清减轻体外NVU模型OGD/R后BBB的渗漏:与对照组比较,模型组TEER值减小,HRP渗透性升高（均P＜0.01）;与模型组比较,电针血清干预后TEER值增大,HRP渗透性降低（均P＜0.01）;与电针血清组比较,抑制剂干预后TEER值减小,HRP渗透性升高（均P＜0.01）。5.电针血清促进NVU模型OGD/R后紧密连接蛋白表达并抑制MMP-9表达:OGD/R后Claudin-5、Occludin和ZO-1表达下调,MMP-9表达上调（均P＜0.01）。电针血清干预促进Claudin-5、Occludin表达,抑制MMP-9表达（均P＜0.01）。抑制剂干预对电针血清具有拮抗作用（均P＜0.01）。6.电针血清降低NVU模型OGD/R损伤后的氧化应激水平:OGD/R处理后,NVU模型内ROS、MDA、LDH水平升高,SOD活性减弱（均P＜0.05）。电针血清干预后,ROS、MDA、LDH水平降低,SOD活性增强（均P＜0.05）。抑制剂干预可逆转电针血清的作用（均P＜0.05）。7.电针血清激活Wnt/β-catenin信号通路,并促进NVU标志蛋白的表达:OGD/R后Wnt1、β-catenin、VEGF、GFAP、Neu N表达下调,GSK-3β表达上调（均P＜0.01）。电针血清干预促进Wnt1、β-catenin、VEGF、GFAP、Neu N表达,抑制GSK-3β表达（均P＜0.01）。抑制剂干预抑制了电针血清的作用（均P＜0.05）。结论:1.电针血清对体外NVU模型OGD/R损伤的神经保护作用与抗凋亡、抗氧化及改善BBB功能相关。2.电针血清可通过调控Wnt/β-catenin信号通路减轻体外NVU模型OGD/R损伤。