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类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis,RA）是一类以滑膜炎症及炎性免疫细胞浸润为主要病理特征的自身免疫疾病。目前,RA的发病机制尚未完全明确,但已有大量文献证实,巨噬细胞的活化、浸润及极化参与了RA的发病进程。巨噬细胞根据表型主要分为促炎M1型巨噬细胞以及抑炎M2型巨噬细胞。在正常生理状态下,两种表型的巨噬细胞以一定比例混合存在于机体中,维持动态平衡;在RA患者体内,处于滑膜免疫微环境中的巨噬细胞M1/M2比例失衡,细胞向M1型方向极化,M1/M2比例升高,炎症反应加剧。鞘氨醇激酶1（Sphingosine Kinases,Sph K1）是生物体鞘脂代谢的关键限速酶,主要表达于细胞质,在胞质中可被磷酸化激活移位至质膜上（转位）,催化鞘氨醇（Sphingosine,Sph）向1磷酸鞘氨醇（Sphingosine 1 Phosphate,S1P）转化的关键分子。S1P与G蛋白偶联受体家族中1-磷酸鞘氨醇受体（S1P Receptors,S1PRs）结合,介导下游多级信号转导,参与炎症、细胞增增、血管新生等生物学活动,与炎症反应密切相关,在RA病程中具有重要的作用。在RA患者及实验性关节炎动物模型中巨噬细胞炎症极化失衡与Sph K1转位是否具有一定的联系尚未有研究报道。栀子苷（Geniposide,GE）是中药栀子主要活性成分,具有抗炎免疫作用。前期研究发现GE对佐剂性关节炎大鼠具有良好的治疗作用,能够抑制Sph K1的激活,降低S1P的生成水平,抑制成纤维样滑膜细胞的异常增殖,发挥抗炎作用。但GE针对巨噬细胞极化分型失衡是否具有一定的调控作用,其具体的作用机制尚未明确,是本文重点探讨的内容。1目的观察Sph K1转位对AA（Adjuvant Arthritis,AA）小鼠巨噬细胞和RAW264.7细胞极化的影响,探究GE对巨噬细胞极化的调节作用和具体机制,为揭示Sph K1转位参与RA巨噬细胞M1/M2比例失衡,Sph K1作为GE的作用靶点调控巨噬细胞极化提供实验依据。2方法将32只小鼠分为4组:空白对照组,模型组,GE给药组（120 mg/kg）,MTX（1 mg/kg）给药组。除空白组外,其余各组利用完全弗式佐剂构建AA小鼠模型,14天后连续灌胃7天给药处理。利用全身表现评分、关节炎指数及关节肿胀数对各组关节炎症程度评分,以HE染色检测滑膜组织病理形态学,ELISA检测血清中细胞因子TNF-α、IL-12、IL-8、IL-10及S1P的分泌水平。第22天分离培养各组骨髓源巨噬细胞（Bone Marrow Derived Macrophage,BMDM）,显微观察细胞形态,流式细胞术检测F4/80、CD11b巨噬细胞表型鉴定细胞纯度,免疫荧光及Western Blot巨噬细胞中i NOS,Arg1表达与分布,流式细胞术检测CD86,CD206水平鉴定巨噬细胞极化分型比例,中性红吞噬法检测巨噬细胞吞噬能力,ELISA检测细胞因子分泌水平。体外利用LPS（100 ng/m L）及IFN-γ（20 ng/m L）联合刺激RAW264.7细胞向M1型极化,IL-4（20 ng/m L）诱导细胞向M2型极化。CCK-8及Griess试剂法探寻GE适宜干预浓度与时间。Sph K1特异性抑制剂PF543（100 n M）,S1P抑制剂FTY720（5μM）干预诱导向M1型方向极化的巨噬细胞,流式细胞术,免疫荧光,Western Blot,RT-q PCR检测巨噬细胞极化分型比例。中性红吞噬法检测巨噬细胞吞噬能力,ELISA检测细胞因子分泌水平。Western Blot检测胞膜胞浆p-Sph K1蛋白表达。3结果3.1 AA小鼠模型的建立及其巨噬细胞M1/M2比例的变化与正常组相比,AA小鼠组两侧后足出现肿胀,其关节炎指数、关节肿胀数及全身表现评分均明显升高;HE染色结果显示模型组滑膜组织异常增生,炎性细胞浸润;ELISA结果表明AA小鼠血清TNF-α、IL-12、IL-8促炎细胞因子水平升高,IL-10抑炎细胞因子水平下降。AA小鼠BMDM与正常组对比,巨噬细胞M1标记i NOS水平上升,M2标记Arg1水平降低;CD86/CD206的比例升高,巨噬细胞吞噬作用增强,细胞上清TNF-α、IL-12、IL-8促炎细胞因子水平升高,IL-10抑炎细胞因子水平下降。3.2 GE对AA小鼠治疗作用及对BMDM及M1型RAW264.7细胞的干预作用GE（120 mg/kg）灌胃给药7天后,AA小鼠关节炎指数、关节肿胀数及全身表现评分均有不同程度的下降,滑膜细胞排列整齐,炎性细胞聚集浸润减少,滑膜细胞增生相对减少,血清中促炎细胞因子水平显著下降,表明GE对AA小鼠具有治疗作用。GE能够下调AA小鼠BMDM及M1型RAW264.7细胞中i NOS水平,上调Arg 1水平,升高CD86/CD206的比例,降低巨噬细胞异常的吞噬水平,降低细胞上清中TNF-α、IL-12、IL-8促炎细胞因子水平,提高IL-10抑炎细胞因子水平。此外GE体外干预后,M1型标记Mincle水平下降,M2型标记Ym-1水平上升。说明GE对巨噬细胞M1/M2比例失衡具有调节作用。3.3 Sph K1转位对巨噬细胞比例失衡的影响及GE的作用AA小鼠较正常小鼠BMDM细胞高表达Sph K1蛋白,其血清及BMDM上清中S1P的分泌量较正常组显著上升。此外较正常组,LPS及IFN-γ联合刺激诱导的M1型RAW264.7细胞上清中S1P水平升高。用GE-100μM,Sph K1选择性抑制剂（PF543-100 n M）,S1P抑制剂（FTY720-5μM）等药物干预诱导向M1型极化的RAW264.7细胞,结果显示,细胞中i NOS表达水平下降,Arg1水平上升,CD86/CD206的比例有所升高,巨噬细胞异常的吞噬水平被降低,细胞上清促/抑炎细胞因子动态平衡被恢复。同时,GE可下调AA小鼠BMDM中Sph K1的表达,抑制S1P水平。GE干预M1型RAW264.7细胞后,胞膜中p-Sph K1含量显著减少,而胞质中该蛋白表达量略微降低,细胞上清S1P分泌水平显著降低。4结论AA小鼠骨髓源巨噬细胞中M1/M2比例上升,GE（120 mg/kg）能够降低M1/M2比例,恢复M1型,M2型巨噬细胞平衡,抑制巨噬细胞异常炎症状态,恢复促/抑炎因子平衡,缓解AA小鼠炎症状态。AA小鼠血清和骨髓源巨噬细胞中S1P水平升高,且骨髓源巨噬细胞中Sph K1蛋白表达量升高,Sph K1转位诱导AA小鼠巨噬细胞向M1型极化。GE主要通过抑制Sph K1转位,下调S1P水平,促进巨噬细胞向M2型方向极化,恢复M1/M2比例平衡,恢复促/抑炎细胞因子平衡,发挥其抗炎免疫调节作用。