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Wilson病（Wilson’s disease,WD）是铜代谢障碍疾病的典型代表性疾病,部分WD患者特别是脑型患者伴有较明显认知功能障碍,表现为记忆力减退、学习能力和处理问题能力下降,严重影响患者的工作、学习等生活质量。因此,加强对伴有认知功能障碍的脑型WD患者的治疗并研究与之相关的脑损伤机制,是WD临床诊疗的重要研究内容,对其病情的减轻、恢复及预后的改善有重要意义。突触功能障碍是多种中枢神经系统疾病认知功能损害的重要机制,研究证实高铜可降低突触蛋白表达,诱导突触功能障碍,进而损伤认知功能。有研究报道,脑内铜沉积可诱导ROS大量释放,产生氧化应激损伤,激活PKR/e IF2α通路,PKR可诱导e IF2α的磷酸化,进而调控突触可塑性,损伤小鼠的认知功能。P-e IF2α还可通过活化转录激活因子4（activating transcription factor 4,ATF-4）,从而调控c AMP反应元件结合蛋白（c AMP response elements binding protein,CREB）和促凋亡分子C/EBP同源蛋白（C/EBP homology protein,CHOP）的表达,诱导神经元凋亡,降低突触后致密物-93（postsynaptic density-93,PSD-93）、突触后致密物-95（postsynaptic density-95,PSD-95）、突触蛋白1（Synapsin1）等突触相关蛋白的表达水平,损伤突触功能,进而导致认知功能障碍。因此,脑内铜大量蓄积引起的氧化应激,激活PKR/e IF2α通路,可能是脑型WD患者发生认知功能障碍的原因。近来本研究团队以通腑养髓法组方“肝豆汤改良方”治疗脑型WD患者,获一定临床疗效。在此基础上,本团队以WD模型TX小鼠为研究对象的实验发现,肝豆汤改良方可减轻TX小鼠神经元的氧化应激损伤,抑制神经元的凋亡,改善TX小鼠神经行为学异常。为此,本研究以TX小鼠为WD模型小鼠,观察肝豆汤改良方对TX小鼠脑内氧化应激水平、突触相关蛋白、PKR/e IF2α通路相关蛋白等影响,阐明肝豆汤改良方调控PKR/e IF2α通路减低高铜诱导突触功能障碍的作用靶点和作用环节。第一部分研究目的:中药肝豆汤改良方对Wilson病模型TX小鼠突触功能障碍的调控作用。方法:采用旷场实验与巴恩斯迷宫实验评价各组小鼠的认知功能;采取TUNEL染色法观察各组小鼠海马神经元损伤;免疫荧光技术监测各组小鼠海马8-OHd G的表达量;运用Western Blotting法分析各组小鼠突触相关蛋白及通路相关蛋白的表达水平。结果:1.肝豆汤改良方对TX小鼠认知功能的影响:旷场实验结果显示:与DL组相比,TX组中央路程与中央时间减少,边上路程与边上时间增加,差异均具有显著统计学意义;TX+MGDD组中央路程与中央时间显著高于TX组（P＜0.01）,边上路程与边上时间低于TX组（P＜0.05）。巴恩斯迷宫结果显示:与DL组相比,TX组找到目标洞口的潜伏期及头部探究潜伏期时间显著增加（P＜0.01）;TX+MGDD组找到目标洞口的潜伏期及头部探究潜伏期时间显著低于TX组（P＜0.01）。TUNEL染色结果显示:TX组海马神经元凋亡数目较DL组显著增加（P＜0.01）;与TX组相比,TX+MGDD组海马神经元凋亡数目显著减少（P＜0.01）。2.肝豆汤改良方对TX小鼠海马突触蛋白表达的影响:Western Blotting结果显示:与DL组相比,TX组PSD93、PSD95、Synaptophysin、、Synapsin1、VAMP2蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）,经肝豆汤改良方治疗后,可显著增加PSD93、PSD95、Synaptophysin、Synapsin1、VAMP2蛋白表达水平（P＜0.01）。3.肝豆汤改良方对TX小鼠海马神经元氧化应激水平的影响:免疫荧光结果显示:与DL组相比,TX组海马8-OHd G表达显著增加（P＜0.01）;与TX组比较,TX+MGDD组8-OHd G表达显著减少（P＜0.01）。4.肝豆汤改良方对TX小鼠海马PKR/e IF2α通路相关蛋白表达的影响:Western Blotting结果显示:TX组P-PKR、P-e IF2α、CHOP及ATF4蛋白表达水平较DL组显著增加,P-CREB的表达水平较DL组显著降低（P＜0.01）;经肝豆汤改良方治疗后,P-PKR、P-e IF2α、CHOP、ATF4蛋白表达水平降低,P-CREB表达水平增加,差异均具有显著统计学意义。结论:中药肝豆汤改良方可减轻高铜诱导的突触功能障碍,改善Wilson病模型TX小鼠认知功能损伤症状。第二部分研究目的:调控PKR/e IF2α通路研究肝豆汤改良方干预Wilson病模型TX小鼠突触功能障碍的机制方法:通过Western Blotting法验证TX小鼠海马siPKR;采用旷场实验与巴恩斯迷宫实验评价各组小鼠的认知功能;采取TUNEL染色法观察各组小鼠海马神经元损伤;免疫荧光技术监测各组小鼠海马8-OHd G的表达量;运用Western Blotting法分析各组小鼠突触相关蛋白及通路相关蛋白的表达水平。结果:1.TX小鼠海马siPKR验证:Western Blotting结果显示,siPKR组P-PKR表达水平显著低于TX组（P＜0.01）。2.siPKR对肝豆汤改良方治疗TX小鼠认知功能的影响:旷场实验结果显示:siPKR+MGDD组中央路程、中央时间、边上路程、边上时间较siPKR组差异无统计学意义（P＞0.05）;巴恩斯迷宫实验结果显示:与siPKR组比较,siPKR+MGDD组找到目标洞口的潜伏期及头部探究潜伏期时间差异无统计学意义（P＞0.05）;TUNEL染色结果显示:siPKR+MGDD组神经元凋亡数目与siPKR组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。3.siPKR对肝豆汤改良方治疗TX小鼠海马突触蛋白表达的影响:Western Blotting结果显示:与siPKR组相比,siPKR+MGDD组PSD-93、PSD-95、VAMP2蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）,Synaptophysin、Synapsin1蛋白表达水平增加（P＜0.05）。4.siPKR对肝豆汤改良方治疗TX小鼠海马氧化应激水平的影响:与siPKR组相比,siPKR+MGDD组8-OHd G表达量减少,但差异无统计学意义（P＞0.05）。5.siPKR对肝豆汤改良方治疗TX小鼠海马PKR/e IF2α通路相关蛋白表达的影响:siPKR+MGDD组P-PKR、P-CREB、CHOP及ATF4蛋白表达水平较siPKR组差异无统计学意义（P＞0.05）,P-e IF2α蛋白表达水平降低（P＜0.05）。结论:PKR/e IF2α通路是肝豆汤改良方调控高铜诱导突触功能障碍的重要环节。肝豆汤改良方可通过抑制PKR/e IF2α通路,促进突触相关蛋白表达,改善突触功能障碍,减低Wilson病模型TX小鼠认知功能障碍。