当今社会，人口老龄化已成为社会问题，老年医学及抗衰老研究倍受推崇，寻求行之有效的抗衰老措施、提高生存质量成为当务之急。近年的研究证实，作为神经内分泌器官的松果体，其分泌的多肽及吲哚激素，尤其是褪黑素(melatonin，MT)除参与生殖反应、炎症免疫反应、疼痛、睡眠等机体调节作用外，尚有显著的自由基清除性抗衰老功效，因而外源性MT的摄入已成为治疗老年性疾病的手段之一，但目前运用的外源性MT临床疗效远不近人意，其毒副作用尚缺乏明确的统计及检测。采用组织工程技术体外构建松果体组织并植入体内，发挥其分泌功能，替代因松果体钙化性MT和其他多肽激素的血浆低浓度及由此引发的一系列衰老过程，同时避免应用外源性MT的单一疗效及其毒副作用，应不失为一种有前景的抗衰老手段。本课题从这一目标入手，进行了松果体细胞的体外培养、微囊包裹研究，探讨松果体细胞微囊移植对MT低血浆浓度的改善情况，为采用组织工程技术对抗衰老提供基本的实验和技术手段。 材料和方法 (1)．采用胶原酶、胰酶两步消化法获取分散的SD乳鼠松果体细胞悬液，接种、培养，相差显微镜观察细胞贴壁、生长及其形态、结构特点，建立松果体细胞体外培养体系。 (2)．采用MTT法、BrdU掺入、5-HT免疫细胞化学法，HPLC、透射电镜、RT-PCR等技术分析松果体细胞在体外不同培养时间段的增殖、分化及功能表达，分析松果体细胞的生物学特性，探寻松果体细胞体外扩增与功能分化的最佳时机。 (3)．采用共轴气流喷射技术，alginate-poly-l-lysine-alginate(APA)微囊包裹松果体细胞，体外培养，分析松果体细胞微囊的生物学特性、免疫隔离效应及囊内细胞的功能状态。(4).分别采用体外培养及直接消化分离的松果体细胞进行微囊 化处理，分析比较不同来源松果体微囊的功能差异，筛选耐 受性、适应性、活性良好的种子细胞用于微囊移植研究。(5).制备去松果体大鼠模型，检测术后MT血浆浓度的动态变化， 评价并明确松果体微囊移植的最佳时机。(6).进行松果体细胞微囊的移植实验，‘探讨回收微囊及囊内细胞 的形态、结构变化，动态分析移植组与对照组以及不同移植 时间的MT变化情况，评价松果体细胞微囊在体内的功能发 挥、免疫屏蔽及其生物相容性。 结果(1).两步消化分离及普通的体外培养条件下(DMEM一F12，含 10%FBS)，松果体细胞贴壁、生长旺盛，原代细胞的良好生 存状态可达6Od。(2).细胞学鉴定确认90%的培养细胞为松果体细胞，细胞的生长 倍增时间为第gd，第lld达高峰;松果体细胞的体外功能状 态呈逐渐恢复趋势，MT的分泌量于第2周开始增加，第3 周达高峰，随后缓慢下降。培养细胞具备功能活跃细胞的超 微结构特征，一月龄原代细胞仍明显可见胞质分泌颗粒，凝 胶电泳检测证实培养细胞MT合成限速酶NAT的表达如常。(3).气流喷射法(l .SBar气压)获得直径400一700um的圆形APA 松果体细胞微囊，囊内细胞存活良好，释放后仍能迅速贴壁 生长，HPLC检测证实微囊化松果体细胞MT分泌功能旺盛， 对肾上腺素能激动剂作用敏感:淋巴细胞转化实验明确了松 果体微囊的免疫隔离效应。(4).直接消化分离获取种子细胞操作简便，但体外培养的松果体 细胞与微囊材料有更好的组织相容性和分泌活性，宜选择培 养后包裹的松果体微囊进行移植研究。(5).大鼠行松果体摘除后血浆MT水平迅速下降，术后第3d末 降至正常血浓度的1/2，15d后夜间血浆MT值难以检测。(6).松果体微囊及对照组(非微囊松果体细胞悬液)移植术后24h 均可检测到MT，并出现昼低夜高节律的部分恢复现象。15(l)(2)(3)(4)(5)d后对照组的MT值难以检测，而松果体微囊移植鼠的平均MT值阳性时间较对照组明显延长，能维持平稳的分泌功能约2周，随后缓慢下降，1月时仅测得微量的MT，45d后微囊及对照组的血MT值检测均为阴性。 结论常规消化及普通体外培养条件下，大鼠松果体细胞贴壁、生长状态良好，确保了体外操作以及筛选活力、生长、功能稳定的种子细胞的可行性。1一7d龄乳鼠松果体原代细胞体外增殖、生长能力旺盛，功能表达于培养第1周末开始恢复，第2一3周间最为活跃，可作为微囊包裹的最佳时间段。喷射法能获得完整的APA松果体细胞微囊，所得微囊形态、直径及包含的细胞数量基本符合实验要求，囊内细胞的活性及功能在一定时间内能保持生理状态，微囊具备良好的免疫隔离效应和生物相容性。囊内细胞于包裹24h后即有分泌功能，可立刻进行移植实验。松果体完全摘除后动物呈现长期的MT低血浆浓度，是研究松果体激素效应的理想模型。建议术后15d为较佳的移植及实验时1’日」。松果体细胞微囊移植在短期内能有效提高异品系模型动物的血浆MT水平，同时部分恢复其生理性昼夜节律，说明APA松果体微囊具备良好的免疫保护效应及生物相容性，采