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目的:探讨海藻酸钠(Alg)/乙二醇壳聚糖(GC)双网络凝胶材料体外刺激对小鼠调节性T细胞(Treg)免疫功能的影响，并探索该双网络凝胶材料对调节性T细胞免疫效应可能的调节机制。
方法:1.制备Alg、GC单网络凝胶材料及双网络凝胶材料(DN-Alg/GC)；采用免疫磁珠分离法分选C57BL/6小鼠脾脏CD4+CD25+Treg。2.实验分为Alg组、GC组、DN组及阴性对照组，各组细胞给予相应刺激因素并继续培养24小时(h)、48h后进行各指标检测。3.应用流式细胞术分析在不同时效、不同培养环境(有无多粘菌素)下CD4+CD25+Treg叉头翼状螺旋转录因子(Foxp3)及细胞毒性T细胞相关抗原(CTLA-4)的表达水平；应用活细胞荧光探针琥珀酰亚安酯(CFSE)标记观察与CD4+CD25+Treg共培养后效应T细胞(Teff)增殖活性的改变；采用酶联免疫吸附分析(ELISA)技术检测CD4+CD25+Treg分泌白细胞介素(IL)-10、转化生长因子(TGF)-β及Teff分泌IL-2、IL-4与干扰素(IFN)-γ的水平。4.选用3-MA自噬抑制剂，观察自噬过程是否参与双网络材料对小鼠CD4+CD25+Treg功能的调控，将实验分组为对照组、DN组、特异性自噬诱导剂rapamycin(30μM)阳性对照组、DN+3-MA(3mM)组，采用激光共聚焦显微镜、蛋白印迹分析(Westernblotting)检测小鼠CD4+CD25+Treg自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ与p62表达情况。
结果:1.培养基中有无多粘菌素B对不同刺激条件、不同时效下CD4+CD25+Treg表面Foxp3和CTLA-4表达水平无明显影响，据此选定实验条件为刺激24h及使用含多粘菌素B的培养基。
2.Alg/GC双网络水凝胶及GC单网络水凝胶作用24h后，与阴性对照组比较，CD4+CD25+Treg表达CTLA-4水平明显升高，TGF-β分泌量增加，差异均具有统计学意义(P＜0.05)；各刺激组Foxp3表达水平无明显差别(P＞0.05)。
3.Alg/GC双网络水凝胶及GC单网络水凝胶刺激组中，CD4+CD25+Treg对Teff增殖活性抑制作用显著增强，共培养后Teff分泌IL-4/IFN-γ比值明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
4.应用rapamycin诱导CD4+CD25+Treg内自噬反应可增强其免疫抑制效应，Foxp3、CTLA-4表达上调，IL-10、TGF-β分泌显著增多，与Teff共培养对细胞增殖活性抑制作用明显增强，IL-2分泌水平明显下降(P＜0.05)，培养基上清中IL-4/IFN-γ比值升高(P＜0.05)，诱导Teff向辅助性T细胞(Th)2方向功能极化。
5.与对照组相比，经DN刺激后的CD4+CD25+Treg中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例明显增加(P＜0.05)，而蛋白p62表达明显下调(P＜0.05)，小鼠CD4+CD25+Treg中LC3puncta数量明显增多(P＜0.05)。对比DN组，加入自噬抑制剂3-MA干预后，CD4+CD25+Treg中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例明显下降(P＜0.05)，蛋白p62表达显著增加(P＜0.05)，CD4+CD25+Treg中LC3puncta数量明显减少(P＜0.05)。
6.应用自噬抑制剂后，对比DN组，DN+3-MA组Foxp3及CTLA-4表达水平较DN组显著下降(P＜0.05)，IL-10及TGF-β分泌量明显降低(P＜0.05)，CD4+CD25+Treg对Teff增殖活性抑制作用减弱，IL-2水平升高(P＜0.05)，共培养后Teff诱生IL-4/IFN-γ比值下降(P＜0.05)。
结论:1.Alg/GC双网络凝胶材料诱导Treg介导的免疫抑制功能显著增强，成分中GC水凝胶可能发挥着主要作用。2.自噬可能是Alg/GC双网络凝胶材料介导小鼠Treg免疫抑制效应的重要机制之一。
方法:1.制备Alg、GC单网络凝胶材料及双网络凝胶材料(DN-Alg/GC)；采用免疫磁珠分离法分选C57BL/6小鼠脾脏CD4+CD25+Treg。2.实验分为Alg组、GC组、DN组及阴性对照组，各组细胞给予相应刺激因素并继续培养24小时(h)、48h后进行各指标检测。3.应用流式细胞术分析在不同时效、不同培养环境(有无多粘菌素)下CD4+CD25+Treg叉头翼状螺旋转录因子(Foxp3)及细胞毒性T细胞相关抗原(CTLA-4)的表达水平；应用活细胞荧光探针琥珀酰亚安酯(CFSE)标记观察与CD4+CD25+Treg共培养后效应T细胞(Teff)增殖活性的改变；采用酶联免疫吸附分析(ELISA)技术检测CD4+CD25+Treg分泌白细胞介素(IL)-10、转化生长因子(TGF)-β及Teff分泌IL-2、IL-4与干扰素(IFN)-γ的水平。4.选用3-MA自噬抑制剂，观察自噬过程是否参与双网络材料对小鼠CD4+CD25+Treg功能的调控，将实验分组为对照组、DN组、特异性自噬诱导剂rapamycin(30μM)阳性对照组、DN+3-MA(3mM)组，采用激光共聚焦显微镜、蛋白印迹分析(Westernblotting)检测小鼠CD4+CD25+Treg自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ与p62表达情况。
结果:1.培养基中有无多粘菌素B对不同刺激条件、不同时效下CD4+CD25+Treg表面Foxp3和CTLA-4表达水平无明显影响，据此选定实验条件为刺激24h及使用含多粘菌素B的培养基。
2.Alg/GC双网络水凝胶及GC单网络水凝胶作用24h后，与阴性对照组比较，CD4+CD25+Treg表达CTLA-4水平明显升高，TGF-β分泌量增加，差异均具有统计学意义(P＜0.05)；各刺激组Foxp3表达水平无明显差别(P＞0.05)。
3.Alg/GC双网络水凝胶及GC单网络水凝胶刺激组中，CD4+CD25+Treg对Teff增殖活性抑制作用显著增强，共培养后Teff分泌IL-4/IFN-γ比值明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
4.应用rapamycin诱导CD4+CD25+Treg内自噬反应可增强其免疫抑制效应，Foxp3、CTLA-4表达上调，IL-10、TGF-β分泌显著增多，与Teff共培养对细胞增殖活性抑制作用明显增强，IL-2分泌水平明显下降(P＜0.05)，培养基上清中IL-4/IFN-γ比值升高(P＜0.05)，诱导Teff向辅助性T细胞(Th)2方向功能极化。
5.与对照组相比，经DN刺激后的CD4+CD25+Treg中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例明显增加(P＜0.05)，而蛋白p62表达明显下调(P＜0.05)，小鼠CD4+CD25+Treg中LC3puncta数量明显增多(P＜0.05)。对比DN组，加入自噬抑制剂3-MA干预后，CD4+CD25+Treg中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例明显下降(P＜0.05)，蛋白p62表达显著增加(P＜0.05)，CD4+CD25+Treg中LC3puncta数量明显减少(P＜0.05)。
6.应用自噬抑制剂后，对比DN组，DN+3-MA组Foxp3及CTLA-4表达水平较DN组显著下降(P＜0.05)，IL-10及TGF-β分泌量明显降低(P＜0.05)，CD4+CD25+Treg对Teff增殖活性抑制作用减弱，IL-2水平升高(P＜0.05)，共培养后Teff诱生IL-4/IFN-γ比值下降(P＜0.05)。
结论:1.Alg/GC双网络凝胶材料诱导Treg介导的免疫抑制功能显著增强，成分中GC水凝胶可能发挥着主要作用。2.自噬可能是Alg/GC双网络凝胶材料介导小鼠Treg免疫抑制效应的重要机制之一。