论文部分内容阅读
β-淀粉酶(β-amylase,EC 3.2.1.2),又称麦芽糖苷酶或糖原淀粉酶。β-淀粉酶在淀粉糖、酿造、日化、医药等工业生产领域已具有广泛的应用。目前商品化的β-淀粉酶多为植物来源,而另一方面,由于微生物β-淀粉酶具有纯度高、质量稳定、生产工艺简单等优势,一直得到研究者的青睐。本研究将来源于弯曲芽孢杆菌的β-淀粉酶在短小芽孢杆菌中进行重组表达,并对重组菌进行发酵优化,提高了重组酶的表达水平。为了探究重组β-淀粉酶的应用价值,依次对其进行了蛋白纯化、酶学性质以及酶转化应用研究。然后根据重组β-淀粉酶应用过程中的缺陷对其进行分子改造,通过定点突变获得突变体并对其应用效果进行了探究。主要研究结果如下:(1)以本实验室筛选保藏的野生弯曲芽孢杆菌B.flexus为基础,通过分子操作构建得到含有β-淀粉酶基因的重组菌株B.choshinensis/pNCMO2-amy。重组菌摇瓶培养48 h后发酵上清酶活达1669 U?mL-1。同时SDS-PAGE蛋白电泳结果显示在重组β-淀粉酶理论大小57.6 kDa附近出现特征条带,表明来源于B.flexus的β-淀粉酶基因已经在短小芽孢杆菌中成功表达。(2)为了降低生产成本、提高重组酶的表达量,首先在摇瓶水平对重组菌发酵条件进行优化,最优结果为15 g?L-1大豆蛋白胨和5 g?L-1牛肉浸膏作为氮源,初始碳源为浓度20 g?L-1的葡萄糖,该条件下重组酶表达量达到2516 U?mL-1。以此为基础进一步在3-L发酵罐水平上对氮源浓度与发酵温度进行优化,当氮源浓度为20 g?L-1,在35℃发酵40h时,最高酶活为4472 U?mL-1。(3)对重组β-淀粉酶进行蛋白分离纯化以及酶学性质分析。结果表明,重组β-淀粉酶最适反应pH为7.0,最适反应温度为50℃,在该条件下重组酶的半衰期为37 h。重组β-淀粉酶对可溶性淀粉的Vmax、Km、Kcat以及Kcat/Km分别为3164 U?mg-1、1.84 mg?mL-1、2373.3 s-1和1291.9 mL·s-1·mg-1,比活为2656 U?mg-1。(4)对影响重组β-淀粉酶以马铃薯淀粉为底物制备麦芽糖的因素进行探究,最终得到了以30%(w/v)马铃薯淀粉为底物制备麦芽糖的最优工艺:在pH为6.5,55℃,重组β-淀粉酶加酶量为200 U?g-1干淀粉时,麦芽糖转化率达到71.31%。在此基础上与异淀粉酶、麦芽糖淀粉酶进行复配可进一步提高麦芽糖转化率:当异淀粉酶的添加量为25U?g-1干淀粉,麦芽糖淀粉酶加酶量为50 U?g-1干淀粉时转化率达到最高值,为86.9%。(5)采用PCR介导的定点突变的方法构建了突变体,并对其进行酶学定性。结果显示突变体L396K最适反应pH为5.5,最适反应温度为60℃,应用该突变体进行酶转化生产麦芽糖,在pH为5.5,温度60℃,突变体L396K加酶量为100 U?g-1干淀粉时,麦芽糖转化率为80.2%。在此基础上与普鲁兰酶、麦芽糖淀粉酶进行复配,麦芽糖转化率可达到91.3%。