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研究背景鼻咽癌是鼻咽上皮细胞来源的恶性肿瘤,在中国广东,香港等南方城市发病率比较高。就现在的治疗方案来看,鼻咽癌的标准化治疗是以调强放射治疗或联合放疗及化学治疗的方案。虽然原发性鼻咽癌经过放射治疗和放化疗后5年生存率已明显提高,但是局部晚期和转移性鼻咽癌的治疗效果差,手段少。随着对肿瘤学研究的深入,越来越多的证据表明,一小部分肿瘤细胞具有自我更新的能力和干细胞样细胞的特性,即肿瘤干细胞的亚群,在肿瘤起始及对放化疗抗性中起重要作用。肿瘤干细胞的存在可能是标准治疗后肿瘤复发率高的原因之一。因此,针对肿瘤干细胞这个特殊的细胞群体的靶向治疗是鼻咽癌治疗后克服肿瘤复发的新策略。在过去的几年中,许多研究说明了EBV阳性鼻咽癌细胞系与原发性肿瘤中的肿瘤干细胞亚群相关。最近的研究表明,EBV编码的蛋白可以在上皮细胞中诱导干细胞样特性。所有被EBV感染的鼻咽癌细胞均表现出II型潜伏期,其表达有EBV病毒核抗原1(EBNA1),LMP1,LMP2A,EBV编码的小RNA(EBER),许多EBV-编码的micro RNA(mi RNA)。其中潜伏膜蛋白1是一种明确的致癌蛋白,负责改变宿主细胞中的多种细胞机制和信号传导途径。越来越多的证据表明,LMP1在鼻咽癌获得干细胞样或祖细胞样细胞的特性中起作用。研究表明LMP1能诱导与细胞侵犯、转移相关因子的表达和通过Twist、Snail诱导上皮间质转化(EMT)。LMP1是唯一参与鼻咽癌细胞分化、转化和恶性肿瘤调控的潜伏蛋白。研究还发现LMP1诱导鼻咽癌上皮细胞转化为肿瘤干细胞,而具备CD44high、CD24low和上皮间质转化表型特征,并说明LMP1阳性鼻咽癌肿瘤干细胞对放疗和化疗抵抗,是治疗后复发与转移的重要因素。因此,抗原LMP1可能是抑制鼻咽癌肿瘤干细胞的理想标靶,为进一步研究LMP1在鼻咽癌细胞发生上皮间质转化过程和获得干细胞特性的分子机制提供研究基础。本课题组先期通过对全人源抗体库的筛选,首次制备人源抗LMP1胞内效应功能区(TES1)抗体Fab(htes Fab),经Western blot鉴定htes Fab能够在原核表达系统内表达并正确组装和分泌。经ELISA、免疫沉淀、细胞免疫荧光以及流式细胞技术鉴定,htes Fab能与LMP1阳性鼻咽癌细胞LMP1胞内效应功能区特异性结合,MTT显示htes Fab有抑制鼻咽癌细胞增殖潜能。目的探讨LMP1在鼻咽癌肿瘤干细胞的影响。进一步了解LMP1在鼻咽癌肿瘤形成中的作用机制。制备抗LMP1特异性抗体htes Fab,分别在细胞水平和个体水平上,分析该抗体对鼻咽癌干细胞及其移植瘤的生长及转移的抑制作用,探讨抗体诱导鼻咽癌干细胞凋亡与抑制细胞生长的分子机制。该研究将有助于阐明抗体Fab靶向LMP1抑制鼻咽癌干细胞生物学活性的分子机制,同时对鼻咽癌新药的研发具有重要的意义。方法1.利用肿瘤干细胞无粘附成球性状分离鼻咽癌肿瘤干细胞亚群,实时定量PCR(q RT-PCR)以及Western blot分析常见的肿瘤干细胞标志物Nanog,Oct4,CD44,CD24,Sox2,ABCG2目标基因的m RNA和蛋白表达情况,建立鼻咽癌肿瘤干性细胞的实验模型。2.构建LMP1-p CMV真核表达质粒,转入鼻咽癌肿瘤干性细胞HNE2,制备高表达LMP1的鼻咽癌肿瘤干性细胞HNE2-LMP1,利用实时定量PCR以及Western blot证实LMP1目标基因的m RNA和蛋白表达情况,同时通过流式细胞术证实鼻咽癌肿瘤干性细胞表面LMP1的阳性表达。3.通过细胞增殖测定和细胞集落形成试验比较HNE2与HNE2-LMP1鼻咽癌干细胞亚群的增殖情况;通过Transwell实验和细胞划痕实验体外测试比较HNE2与HNE2-LMP1鼻咽癌干细胞亚群的侵袭转移影响。利用实时定量PCR以及Western blot分析肿瘤干细胞标志物Nanog,Oct4,CD44,CD24,Sox2,ABCG2目标基因的m RNA和蛋白表达情况,观察LMP1对鼻咽癌干性细胞的影响。4.制备抗LMP1 TES1抗体Fab(htes Fab),通过细胞增殖测定以及细胞集落实验观察htes Fab抑制鼻咽癌干性细胞的增殖影响,并通过流式细胞仪分析抗体诱导鼻咽癌干细胞凋亡情况。利用实时定量PCR以及Western blot分析htes Fab对鼻咽癌干性细胞增殖相关下游基因细胞周期蛋白分子CCNA2,CCND1表达影响。5.htes Fab抗体作用鼻咽癌干性细胞后,Western blot检测分别检测PI3K,磷酸化PI3K,Akt和磷酸化Akt的蛋白水平的变化。探讨htes Fab通过PI3K/Akt途径抑制鼻咽癌干性细胞的增殖。6.构建鼻咽癌荷瘤裸鼠动物模型,htes Fab抗体作用后观察荷瘤裸鼠的肿瘤生长情况测量肿瘤大小,30天后处死裸鼠后HE染色观察肿瘤组织坏死的情况,用TUNEL分析肿瘤组织细胞凋亡情况。通过免疫组化分析磷酸化PI3K和磷酸化Akt的蛋白水平的变化情况。7.通过Transwell实验以及细胞划痕实验观察htes Fab抑制鼻咽癌干性细胞的侵袭和转移的影响。利用实时定量PCR以及Western blot分析htes Fab对鼻咽癌干性细胞EMT的相关基因E-cadherin、N-cadherin、vimentin、?-catenin以及E-cadherin抑制转录因子slug的相对m RNA表达水平以及蛋白表达影响。Western blot检测β-catenin蛋白表达水平,探讨htes Fab对Wnt/β-catenin信号通路的影响。8.htes Fab抗体作用荷瘤裸鼠模型,通过动物荧光成像观察抗体对鼻咽癌肿瘤转移的影响。通过免疫组化观察抗体对肿瘤组织中EMT的相关基因E-cadherin、N-cadherin、vimentin、?-catenin以及转录因子slug的表达影响。结果1.鼻咽癌细胞系HNE2细胞接种于无血清培养液,呈球形聚集生长,经q RT-PCR和Western blot分析证实鼻咽癌细胞系HNE2细胞球中的干细胞相关基因CD44、Sox2、ABCG2、Nanog和Oct4高表达,而亲代的HNE2细胞系干性基因表达量较低。2.通过双酶切鉴定结果显示LMP1-p CMV真核表达质粒有LMP1基因,转染鼻咽癌肿瘤干性细胞HNE2后,鼻咽癌肿瘤干性细胞HNE2-LMP1表达LMP1蛋白,利用实时定量PCR以及Western blot证实鼻咽癌肿瘤干性细胞HNE2-LMP1中LMP1的m RNA与蛋白水平升高,同时通过流式细胞术检测到鼻咽癌肿瘤干性细胞表面LMP1的表达阳性。3.通过细胞增殖测定结果显示过表达LMP1后HNE2-LMP1微球细胞较HNE2微球细胞增殖能力明显增强,差异有统计学意义。细胞集落形成试验结果显示比较与HNE2-LMP1鼻咽癌干细胞亚群比HNE2在相同的时间内能形成更多的细胞集落。通过Transwell实验结果显示HNE2-LMP1微球细胞组平均细胞迁移数明显多于HNE2微球细胞组。细胞划痕实验体外测试显示划痕48h后HNE2微球细胞恢复近43%而HNE2-LMP1微球细胞在伤口恢复达94%。利用实时定量PCR以及Western blot分析肿瘤干细胞标志物Nanog,Oct4,CD44,CD24,Sox2,ABCG2目标基因的m RNA和蛋白表达情况,结果显示与HNE2相比较HNE2-LMP1鼻咽癌干细胞亚群的肿瘤干细胞标志物高表达。4.利用实验原有成熟的技术成功制备表达纯化htes Fab抗体。通过细胞增殖测定,结果显示随着时间推移,PBS组肿瘤微球细胞增殖速度最快,其次是htes Fab组和LY294002(PI3K抑制剂)组,而htes Fab+LY294002组细胞增殖的最慢,在72小时后更加明显。细胞集落实验可观察到PBS组细胞集落数明显多于LY294002(PI3K抑制剂)组,htes Fab组细胞和htes Fab+LY294002组的细胞集落数。并通过流式细胞仪分析结果显示PBS组,LY294002(PI3K抑制剂)组,htes Fab组,htes Fab+LY294002组早期凋亡率分别是5.89%,9.32%,14.6%,21.8%;利用实时定量PCR以及Western blot分析结果显示与阴性对照组PBS组相比,htes Fab组,LY294002组,htes Fab+LY294002组细胞周期蛋白CCNA2和CCND1的m RNA和蛋白质表达水平下降。5.htes Fab抗体作用鼻咽癌干性细胞HNE2-LMP1后,Western blot检测结果显示对照组的PI3K,Akt,磷酸化PI3K(p-PI3K)和磷酸化Akt(p-Akt)的蛋白水平无明显变化,而htes Fab组、LY294002组和htes Fab+LY294002组的磷酸化PI3K(p-PI3K)和磷酸化Akt(p-Akt)下调,以htes Fab+LY294002组明显下调。但是四组PI3K,Akt的蛋白水平无明显变化。6.构建鼻咽癌荷瘤裸鼠动物模型,分别在第1、6、11、16、21天向裸鼠腹膜内注射不同的药物,经过观察肿瘤生长情况及大小,结果显示在第一次瘤内注射后10天,htes Fab+LY294002组肿瘤体积小于PBS组;在第15,20,25,30天时,htes Fab+LY294002组、htes Fab组和LY294002组肿瘤体积明显小于PBS组。htes Fab+LY294002组、htes Fab组和LY294002组抑瘤率分别是:45%,19%,27.4%。处死裸鼠后肿瘤组织HE染色后显微镜下观察htes Fab抗体和LY294002导致裸鼠肿瘤组织坏死。用TUNEL方法观察到htes Fab+LY294002组、htes Fab组和LY294002组的肿瘤组织细胞颗粒染色明显增加,而PBS组无明显染色。通过免疫组化分析观察到同样的结果。7.通过Transwell实验观察到细胞迁移48小时后PBS组每个镜下视野中平均细胞迁移数明显多于htes Fab组,XAV-939(Wnt/β-catenin抑制剂)组和htes Fab+XAV-939组的平均细胞迁移数。细胞划痕实验观察划痕48h后PBS组细胞恢复近87%而htes Fab组,XAV-939组和htes Fab+XAV-939组在伤口恢复分别为42%,38%,17%。利用实时定量PCR以及Western blot分析结果显示htes Fab上调EMT的相关基因E-cadherin、下调N-cadherin、vimentin、?-catenin以及E-cadherin抑制转录因子slug的相对m RNA表达水平以及蛋白表达水平。Western blot检测到htes Fab与XAV-939都能够抑制β-catenin蛋白表达水平,提示htes Fab可能通过Wnt/β-catenin信号通路的影响鼻咽癌干性细胞的侵袭和转移。8.htes Fab抗体作用荷瘤裸鼠模型,通过动物荧光成像观察到htes Fab组、XAV-939组、htes Fab+XAV-939组肿瘤细胞无明显转移,而对照组PBS对照组有鼻咽癌肿瘤转移。通过免疫组化结果显示与对照PBS组相比,htes Fab+XAV-939组、htes Fab组和XAV-939组肿瘤组织中EMT的相关基因N-cadherin、vimentin、?-catenin以及转录因子slug的蛋白表达水平下降,E-cadherin上调。结论1.鼻咽癌细胞系HNE2细胞接种于无血清培养液,呈球形聚集生长,鼻咽癌细胞系HNE2细胞球中的干细胞相关基因CD44、Sox2、ABCG2、Nanog和Oct4高表达、CD24低表达,且具有较强的肿瘤干细胞特性,可作为鼻咽癌干细胞的良好模型。2.成功构建LMP1-p CMV真核表达质粒,转染鼻咽癌肿瘤干性细胞HNE2,制备高表达LMP1的鼻咽癌肿瘤干性细胞HNE2-LMP1,鼻咽癌肿瘤干性细胞HNE2-LMP1表面LMP1的表达阳性。HNE2-LMP1鼻咽癌干细胞亚群比HNE2有更强的增殖能力和侵袭转移能力。HNE2-LMP1鼻咽癌干细胞亚群的肿瘤干细胞标志物高表达。证实LMP1在维持鼻咽癌的肿瘤干性中起重要作用。3.通过细胞增殖测定以及细胞集落实验可观察到htes Fab与LY294002(PI3K通路抑制剂)协同抑制鼻咽癌干性细胞的增殖影响,诱导鼻咽癌干细胞HNE2-LMP1凋亡。并且htes Fab抗体抑制了鼻咽癌干性细胞增殖相关下游基因细胞周期蛋白分子CCNA2,CCND1表达,与LY294002有相似的抑制效果。在htes Fab抗体与LY294002作用鼻咽癌干细胞后磷酸化PI3K和磷酸化Akt蛋白水平明显下降而PI3K和Akt的蛋白水平无变化。提示htes Fab抗体通过PI3K/Akt途径抑制鼻咽癌干性细胞的增殖。4.htes Fab抗体与LY294002有抑制荷瘤裸鼠的肿瘤生长作用,导致裸鼠肿瘤组织坏死,使肿瘤组织细胞凋亡明显增加。并且在体内实验中证实htes Fab与LY294002同样具有抑制PI3K和Akt磷酸化的作用。5.htes Fab抗体可以抑制鼻咽癌干性细胞的侵袭和转移,与XAV-939(Wnt/β-catenin抑制剂)有类似的作用。htes Fab抗体下调鼻咽癌干性细胞EMT的相关基因N-cadherin、vimentin、?-catenin以及转录因子slug的相对m RNA以及蛋白表达水平并使E-cadherin表达上调。同时htes Fab与XAV-939都能够抑制β-catenin蛋白表达水平,提示htes Fab可能通过Wnt/β-catenin信号通路的影响鼻咽癌干性细胞的侵袭和转移。6.通过动物荧光成像观察到htes Fab抑制鼻咽癌肿瘤转移。体内实验表明htes Fab下调肿瘤组织中EMT的相关基因N-cadherin、vimentin、?-catenin以及转录因子slug的蛋白表达水平,上调E-cadherin表达。htes Fab抗体在鼻咽癌特别是复发性鼻咽癌的治疗中提供新思路。