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研究目的:在骨科临床中,骨骼发育迟缓,各类长骨骨折及骨质疏松症是骨科常见病。目前研究对于促进骨骼生长发育、骨折修复及骨质疏松症相关分子机制的研究很多,但是仍然有许多相关分子未被研究。Corin是一种Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶。其功能主要在心脏及肾脏等组织器官中被研究得很多,但是其与骨发育、骨折愈合及骨质疏松症的相关研究并不多。我们前期研究发现Corin表达水平在人间充质干细胞（hMSCs）诱导分化后显著升高。我们还发现Corin表达下调显著抑制hMSCs向软骨的分化。其他研究还表明Corin通过调节血管内皮细胞生长因子A（vascular endothelial growth factor-A,VEGFA）来影响软骨内骨化。我们前期还对骨密度降低患者进行了研究,发现骨质疏松患者外周血中Corin水平降低,且Corin水平与骨钙素呈负相关。为了进一步探究Corin对于上述生理病理过程中的作用,本课题对比了野生型（WT）小鼠及Corin基因敲除（Corin KO）小鼠相关表型、组织学、影像学及分子学表现。在骨骼发育上,Corin KO小鼠较WT小鼠生长及骨化延迟;在骨折修复愈合过程中,Corin KO小鼠较WT小鼠骨痂生成量少且向硬骨痂的转化延迟;在老年鼠中,发现Corin KO小鼠较WT小鼠的骨质疏松程度更严重。同时,我们发现上述过程可能是Corin通过经典途径,即活化心房利钠肽（atrial natriuretic peptide,ANP）及脑利钠肽（brain natriuretic peptide,BNP）,它们与靶细胞上的A型利钠肽受体（Natriuretic peptide receptor A,NPR-A）结合,提高细胞内的环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate,cGMP）水平,激活 Ⅱ型 cGMP-依赖性蛋白激酶（cGMP-dependent protein kinase-2,PKG2）从而调节了VEGFA 的表达,从而影响了骨骼生长发育。本课题的结果阐述了Corin在骨骼的相关作用及部分机制,为上述提到的相关疾病的诊断及治疗方向提供新的思路。研究方法:1.蛋白酶Corin对骨骼生长发育的影响及作用机制研究（1）运用H＆E染色及免疫组织化学法及免疫荧光法检测Corin在骨骼组织的表达及位置。（2）运用H＆E染色法对比E18.5的两组小鼠骨骼生长板内各细胞层的厚度的差异。（3）运用阿尔新蓝（Alcianblue,软骨）和茜素红（Alizarinred,成骨）染色方法对E18.5的两组小鼠行小鼠整体标本染色,观察小鼠骨发育的整体表型差异。将整体标本分离颅骨后统计对比两组各面观的软骨及成骨面积差异;分离四肢长骨后统计对比两组整体长度及成骨和软骨长度差异。（4）运用免疫组织化学法对P0的WT小鼠胫骨近端进行检测,探究ANP、BNP、NPR-A及X型胶原蛋白（a1链）（COL10a1,由肥大软骨细胞分泌的特定胶原蛋白）的表达及位置。2.蛋白酶Corin对骨折愈合的影响及作用机制研究（1）运用三点折弯原理对成年WT及Corin KO小鼠置入髓内钉固定后的股骨中段行横行骨折造模,分别于术日、术后2周、4周、6周、8周行X-Ray摄片;并取出术后对应周数小鼠股骨行Micro-CT评估对比术后骨折端骨痂形成情况。（2）对骨折后2W及4W的两组小鼠股骨脱钙后行蕃红O/固绿染色,区分并对比骨折端的软骨（红色）和成骨（绿色）量,并对比新骨生成情况。（3）运用免疫组织化学法验证Corin、ANP、NPR-A、COL10a1在骨痂上的表达及定位。3.蛋白酶Corin对骨质疏松症的影响取WT及KO的雄性老年鼠股骨行Micro-CT评估其近端骨小梁并对比骨质疏松程度。研究结果:1.蛋白酶Corin对骨骼生长发育的影响及作用机制研究:（1）Corin在WT小鼠胫骨生长板的肥大前、肥大软骨细胞及骨周围骨膜表达。在生长板内,WT较Corin KO小鼠的肥大细胞区域厚,而增殖区及前肥大细胞区则相反。（2）阿尔新蓝与茜素红染色的整体染色结果显示:Corin KO较WT小鼠的骨发育延迟:颅骨上表现为软骨面积多而成骨面积少;四肢长骨表现为整体长度及成骨长度显著短。（3）在P0的WT小鼠的胫骨近端生长板上发现ANP、BNP、NPR-A、COL10a1与Corin表达的位置相同,即肥大软骨细胞区。2.蛋白酶Corin对骨折愈合的影响及作用机制研究:（1）X-ray及Micro-CT结果提示WT小鼠在骨折后2W及4W时骨痂的形成总量及成骨量均显著大于Corin KO小鼠,而两组在6W及8W时无明显差异。（2）两组骨折端骨痂组织学表现:骨折后2W的WT较Corin KO小鼠股骨骨痂横切面积较大,且有更多的新骨形成;4W时,WT小鼠的股骨基本无软骨痂存在,均转化为成骨,而Corin KO小鼠仍有少部分软骨痂未转化为硬骨痂。（3）免疫组化结果显示:骨折后2W的WT小鼠股骨骨痂内,Corin、ANP、NPR-A及COL10a1表达在肥大软骨细胞尤其是终末的肥大软骨细胞。骨折后4W的WT小鼠股骨骨痂内因无软骨存在,未检测到上述任何蛋白的表达。3.蛋白酶Corin对骨质疏松症的影响Micro-CT结果显示,在雄性老年小鼠中,Corin KO小鼠较WT小鼠的骨质疏松程度严重。结论:1.我们验证了 Corin的确表达于小鼠的生长板且定位于肥大软骨细胞。敲除Corin后,由于Corin的缺失导致小鼠的生长板肥大软骨细胞变少,肥大软骨细胞区变薄,而肥大前软骨细胞及增殖区软骨细胞代偿性的增多致该区变厚。而因为肥大软骨细胞的减少导致小鼠骨骼生长延迟,长骨及其成骨变短;而同时颅骨的骨化也延迟了。2.蛋白酶Corin影响骨骼发育的分子通路之一为Corin-ANP/BNP-NPRA。3.蛋白酶Corin的缺乏影响了骨折的愈合,且影响的是软骨向成骨过程,其分子途径之一也为Corin-ANP-NPRA,导致软骨痂向硬骨痂转化延迟。4.从影像学上看,Corin缺乏的雄性小鼠骨质疏松程度也明显重于WT小鼠。综上所述,本课题证实了Corin在骨骼发育、骨折修复及维持骨稳态都起到了重要的作用。Corin缺失后,骨骼成骨延迟,骨折修复的骨化延迟,骨质疏松程度更为严重。且我们发现了 Corin影响上述过程的分子机制可能为Corin-ANP/BNP-NPRA-VEGFA。这些结果为后续进一步机制研究提供了基础,也为上述生理病理过程相关的疾病提供了新的诊断及治疗思路。