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H9N2亚型禽流感是目前我国流行范围最广泛，危害最大的低致病性禽流感，自从1994年在我国首次分离以来，其流行范围已涉及我国大部分的省市、地区。本实验室前期工作发现，2008年以后，H9N2亚型流感病毒致病力明显增强，本试验选取了两株H9N2亚型流感病毒，分析两毒株生物学特性、基因特性的差异，为流感的防控提供参考和依据。 试验一：H9N2亚型流感病毒基因变异分析及对SPF鸡的致病力研究 为了筛选一对基因组序列高度同源且致病力差异显著的H9N2亚型禽流感病毒，本试验通过分析18株分离自不同时间、不同地区且对鸡胚致死时间不同的H9N2亚型禽流感病毒全基因序列，确定两对符合条件的“病毒对”。通过测定EID50、ELD50、MDT、IVPI确定其致病性。结果显示，A/CK/SD/818/10、A/CK/SD/196/11两毒株基因序列高度同源，对鸡胚及SPF鸡的致病力显著不同，A/CK/SD/818/10为致病力较强的H9N2亚型流感毒株，A/CK/SD/196/11为致病力较弱的H9N2亚型流感毒株。 试验二：两株不同致病力H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列分析 为了找到H9N2毒株致病力增强的分子线索，本研究对致病力存在明显差异的两株H9N2病毒进行了全基因组序列测定和分析。遗传进化分析表明，2株H9N2亚型禽流感病毒发生了基因重配，内部基因来源具有多样性。氨基酸序列分析表明，强致病力毒株A/CK/SD/818/10和A/CK/SD/196/11在HA受体结合位点、NA唾液酸结合位点和潜在糖基化位点处存在显著差异，A/CK/SD/818/10在PA蛋白55位氨基酸和336位氨基酸等重要功能位点处出现了与致病力增强有关的突变，这种致病力增强的分子机制需要进一步探究。 试验三：反向遗传系统的构建及病毒的拯救 为建立强弱致病力H9N2亚型流感病毒的反向遗传操作系统，本研究分别构建了C/SD/818/10、C/SD/196/11两毒株的8个基因组重组质粒，并进行病毒拯救工作。对拯救成功的病毒进行全基因组序列测定，结果表明，拯救出的毒株与野生病毒的核苷酸序列完全一致。这些感染性克隆的构建，为研究H9N2亚型毒株对禽类致病性的分子致病机制奠定了基础。 试验四：对H9N2亚型禽流感病毒HA、NA及NS基因片段的潜在致病性关键位点的变异规律进行统计分析 为了找到与致病力相关的关键氨基酸位点，我们根据致死鸡胚死亡时间的不同对HA、NA、NS三个基因片段的遗传变异情况进行统计分析。结果发现，HA、NA、NS分别有9个、6个、6个关键氨基酸位点在致病力强弱毒株之间差异显著。统计结果表明，这些氨基酸的变异极有可能是潜在的引起H9N2亚型流感病毒致病力增强的关键氨基酸，这种变异是否是致病力增强的分子机制需要通过反向遗传进一步验证。